建立DUX诱导的2CLC模型
获得足量且具有全能样特征的2CLCs用于全基因组增强子报告实验。
构建含Dox诱导Dux转基因和MERVL-LTR-EGFP-F2A-puroR报告系统的iDux-MGP细胞，挑选Clone 3，Dox诱导后流式分选GFP+细胞，并通过转录组、scRNA-seq和嵌合体实验评估2CLC特征及体内全能性。
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全能样细胞中增强子的高通量功能表征
High-throughput functional characterization of enhancers in totipotent-like cells.
实验完整度
高包含STARR-seq、ATAC-seq、ChIP-seq、scRNA-seq、ULI-STARR-seq、荧光报告、eKO、CRISPRi、核移植及胚胎注射等多层级功能与机制验证。
主要模型
DUX诱导的2C样细胞（iDux-MGP Clone 3） 小鼠2C胚胎（E2C/L2C） mESCs（E14Tg2a） 核移植重构胚胎
重点核对
2CLC诱导条件：doxycycline 2 μg/mL处理30 h，6 h后加puromycin筛选 STARR-seq转染：Dox诱导24 h后转染，转染后16 h收样 ULI-STARR-seq：受精卵雄原核注射，L2C阶段（hCG后46–48 h）收样 荧光报告：候选增强子4.5 ng/μL与mCherry 1.5 ng/μL共注射，24 h后检测 eKO验证：单细胞克隆纯合敲除后RT-qPCR，n=3生物学重复
摘要
合子基因组激活（ZGA）标志着胚胎发生中的首次转录事件，但其顺式调控机制尚不清楚。本文利用大规模并行报告实验，在DUX诱导的2C样细胞（2CLCs）中对小鼠基因组中的增强子进行了功能解析。通过整合2CLCs和2C胚胎的表观基因组和转录组数据，描绘了全能细胞中的活跃增强子。其中，相当比例的启动子表现出增强子活性，显示出升高的活跃染色质特征，并与ZGA期间基因表达增强相关。优先富集在增强子-启动子区域的转录因子在调控ZGA和早期胚胎发育中起关键作用。此外，只有一半的MT2_Mm在2CLCs中表现出增强子活性。值得注意的是，2CLC增强子增强了2C胚胎中的转录。最后，在2CLCs和2C胚胎中删除增强子区域，结合dCas9-KRAB-MeCP2介导的体外CRISPRi，共同强调了它们在促进ZGA基因转录中的关键作用。这些发现推进了我们对ZGA过程顺式调控机制的理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 小鼠着床前胚胎ZGA过程中，哪些增强子具有功能活性，其顺式调控机制如何？
- 核心机制
- DUX诱导的2CLCs中活跃增强子（含增强子-启动子和MERVL LTR）通过招募ZGA相关转录因子促进ZGA基因转录；部分启动子具有增强子活性，以不依赖远距离增强子的方式促进ZGA基因表达。
- 主要证据
- 全基因组STARR-seq结合ATAC-seq/ChIP-seq鉴定2CLC增强子；ULI-STARR-seq在2C胚胎验证候选增强子活性；荧光报告验证增强子功能；增强子敲除和dCas9-KRAB-MeCP2 CRISPRi降低靶ZGA基因表达；核移植胚胎中增强子敲除降低Ercc4和Stox1表达；MT2_Mm干扰下调相关ZGA基因。
- 研究意义
- 推进了对ZGA过程顺式调控机制的理解，描绘了全能细胞中的功能增强子，并提示增强子-启动子和MERVL LTR在ZGA中的调控作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
全基因组STARR-seq鉴定功能性增强子
在全基因组范围定量鉴定2CLCs中具有转录增强活性的DNA片段。
构建平均700–1200 bp超声打断基因组DNA的STARR-seq质粒文库，转染Dox诱导的2CLCs，分离质粒DNA和mRNA测序，以input为对照定义STARR peaks。
多组学整合定义2CLC活跃增强子
结合染色质状态和表观修饰区分功能性增强子与预激活或封闭增强子。
在分选的GFP+和GFP−细胞中生成ATAC-seq及H3K4me1、H3K4me3、H3K27ac ChIP-seq，整合STARR-seq数据将增强子分为C1（STARR活性且开放染色质）、C2（STARR活性但封闭染色质）和C3（开放染色质但无STARR活性），重点分析C1。
体内评估2CLC增强子的功能潜力
利用已发表胚胎ATAC-seq和转录组数据评估2CLC增强子在2C胚胎中的开放性和靶基因表达。
将C1增强子与小鼠早期胚胎ATAC-seq数据整合，分析2C特异性、共享和ESC特异性增强子在E2C、2C、8C和ICM阶段的染色质开放性，并关联ZGA基因。
MERVL LTR增强子功能解析
明确MERVL元件中具有增强子功能的亚群及其与ZGA基因的关系。
根据STARR-seq和ATAC-seq信号将MERVL元件分为C1、C2、C3三簇，分析MT2_Mm在2C胚胎中的染色质开放性、转录因子结合和序列完整性，并用dCas9-KRAB和6条sgRNA干扰MT2_Mm。
ULI-STARR-seq在2C胚胎中验证候选增强子
在体内验证2CLC中鉴定的候选增强子是否在2C胚胎中具有增强子活性。
合成88个候选增强子和9个阴性对照序列，克隆入STARR-seq质粒，注射受精卵雄原核，于L2C阶段收集自我转录RNA测序。
荧光报告实验验证增强子活性
验证候选增强子在细胞和胚胎中驱动GFP表达的能力及细胞类型特异性。
将ESC特异性增强子或2C特异性/共享增强子插入含最小启动子的EGFP报告质粒，转染mESCs或与mCherry示踪质粒共注射受精卵，24 h后检测荧光。
增强子敲除与CRISPRi功能验证
验证候选增强子对靶ZGA基因表达的调控作用。
用成对sgRNA/Cas9删除Ercc4、Stox1、Obox6附近增强子，获得纯合克隆，RT-qPCR检测靶基因表达；并通过核移植在体内检测；另用dCas9-KRAB-MeCP2 CRISPRi靶向12个2C特异性远端增强子。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 明胶 | Stem cell | 07903 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141 | |
| 小鼠白血病抑制因子 | Millipore | ESG1107 | |
| β-巯基乙醇 | Gibco | 21985023 | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | 11140050 | |
| GlutaMAX添加剂 | Gibco | 35050061 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 |
| 核型分析 | 秋水仙素 | Sangon Biotech | A600322 |
| 流式分析 | 敲除血清 | Invitrogen | A3181501 |
| 免疫荧光 | 磷酸盐缓冲液 | HyClone | SH30028.02 |
| Triton X-100 | Macklin | T824275 | |
| 驴血清 | Sigma | D9663 | |
| 抗CDX2抗体 | BioGenex | MU392A 5UC | |
| 抗SOX2抗体 | ThermoFisher | 14981182 | |
| 抗mCherry抗体 | Airgo | ARG55723 | |
| 驴抗小鼠IgG（H+L）Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A31571 | |
| 驴抗大鼠IgG（H+L）Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A21208 | |
| 驴抗山羊IgG（H+L）Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A11057 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| 异丙醇 | Macklin | I811925 | |
| RT-qPCR | PrimeScript II逆转录酶试剂盒 | TAKARA | 2690 A |
| TB Green PremixExTaq试剂盒 | TAKARA | RR420 | |
| 总RNA-seq | Illumina Ribo-Zero plus rRNA去除试剂盒 | Illumina | 20037135 |
| scRNA-seq | Chromium Next GEM Chip G单细胞试剂盒 | 10x Genomics | 1000121 |
| STARR-seq文库构建 | NEBNext Ultra II DNA建库试剂盒 | NEB | E7645S |
| AMPure XP磁珠 | Beckman | A63881 | |
| hSTARR-seq_ORI载体 | Addgene | 99296 | |
| Gibson组装试剂盒 | ABclonal | RK21020 | |
| MinElute试剂盒 | Qiagen | 28004 | |
| MegaX DH10B T1R电转感受态细胞 | Invitrogen | C640003 | |
| Plasmid Plus Giga质粒提取试剂盒 | Qiagen | 12991 | |
| ULI-NChIP-seq | H3K27ac抗体 | Active Motif | 39133 |
| H3K4me1抗体 | Cell Signaling Technology | 5326S | |
| H3K4me3抗体 | Cell Signaling Technology | 9751S | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（Index Primers Set 1） | NEB | E7335S | |
| CUT&Tag | p300抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-48343 |
| Hyperactive Universal CUT&Tag检测试剂盒 | Vazyme | TD903 | |
| ATAC-seq | Tn5转座酶及tagmentation缓冲液 | Vazyme | TD502 |
| MinElute PCR纯化试剂盒 | QIAGEN | 28004 | |
| ULI-STARR-seq | 磁性mRNA分离试剂盒 | NEB | S1550S |
| URBO DNase | invitrogen | AM2238 | |
| RNA Clean磁珠 | Vazyme | N412-02 | |
| 胚胎培养 | KSOM培养基 | Millipore | MR-16-D |
| 核移植 | 细胞松弛素B | Sigma | C6762 |
| 秋水仙酰胺 | Sigma | D1925 | |
| 曲古抑菌素A | Sigma | T8552 | |
| 氯化锶 | Sigma | 255521 | |
| 胚胎RT-qPCR | 单细胞序列特异性扩增试剂盒 | Vazyme | P621 |
| ChamQ Universal SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711 | |
| 增强子敲除 | pSpCas9(BB)−2A-Puro（PX459）V2.0载体 | Addgene | 62988 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 2CLC诱导与分选 | Dox浓度2 μg/mL、诱导30 h、6 h后puromycin筛选、Clone 3、GFP+/GFP−分选 阅读提示：Methods中ESC culture and construction of the DUX-induced 2CLC model；Supplementary Fig. 1a–c |
| 全基因组STARR-seq | 基因组DNA片段700–1200 bp、Dox诱导24 h后转染、转染后16 h收样、input对照、两次重复、peak阈值2倍 阅读提示：Methods中Genome-wide STARR-seq library preparation and sequencing；Fig. 1a；Supplementary Fig. 2a–d |
| ATAC-seq与ULI-NChIP-seq | ATAC-seq每样本50,000细胞、两组重复；ULI-NChIP-seq每反应5,000细胞、两组重复；抗体用量1 μg 阅读提示：Methods中ATAC-seq和ULI-NChIP-seq |
| ULI-STARR-seq体内验证 | 88个候选增强子、9个阴性对照、雄原核注射PN3–PN4、L2C阶段hCG后46–48 h收样、两次重复、阳性阈值1.5倍 阅读提示：Methods中ULI-STARR-seq；Fig. 4a–c；Supplementary Data 7 |
| 荧光报告实验 | 候选增强子4.5 ng/μL、mCherry 1.5 ng/μL、共注射受精卵、24 h后检测荧光 阅读提示：Methods中Mouse zygote collection and Injection；Supplementary Fig. 9 |
| 增强子敲除与核移植 | 成对sgRNA、单细胞纯合克隆、RT-qPCR n=3、核移植后L2C阶段31.5–32 h（含6 h激活）收样、TSA 5 nM、SrCl2 10 mM 阅读提示：Methods中Enhancer knockout (eKO) in mESCs和Nuclear transfer；Fig. 4d–f |
| CRISPRi干扰 | dCas9-KRAB-MeCP2质粒、gRNA慢病毒、puromycin 1.5 μg/mL筛选至少3天、Dox 2 μg/mL诱导24–36 h、分选GFP+细胞 阅读提示：Methods中Enhancer interference in mESCs；Fig. 4g |