CAF特异性Lin28b敲除的体内抗肿瘤免疫验证
确定Lin28b+ CAF促瘤作用是否依赖适应性免疫和CD8+ T细胞。
将15376T细胞与WT或Lin28b-KO mCAF共原位移植至WT或Rag1−/−小鼠；在Fsp-Cre;Lin28bfl/fl小鼠中用抗体清除CD8+ T、NK或中性粒细胞；流式检测免疫浸润。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
CAFs通过Lin28b-STING轴塑造胰腺癌的免疫抑制微环境
CAFs shape the immunosuppressive microenvironment of pancreatic cancer through the Lin28b-STING Axis.
实验完整度
高含细胞、类器官样CAF、多种小鼠模型、患者TMA、scRNA-seq和RIP-seq，并有功能与机制验证
主要模型
15376T小鼠PDAC细胞原位移植模型 Fsp-Cre;Lin28bfl/fl及双敲小鼠 小鼠原代CAF与KPC-CAF、人PDAC来源hCAF 人PDAC组织芯片与TCGA-PAAD队列
重点核对
CAF中Lin28b敲除后STING mRNA稳定性及p-TBK1/p-IRF3变化 Lin28b与STING mRNA结合及GGAGA基序依赖性 Lin28b/STING双敲对I型IFN和CD8+ T细胞浸润的影响 α-PD-L1在Fsp-Cre;Lin28bfl/fl小鼠中的疗效及IFNAR1/CD8α阻断 肿瘤CM诱导Lin28b 6天及Wnt5a重组蛋白处理剂量
摘要
癌症相关成纤维细胞包含多种功能不同的细胞亚群，其中某些亚群在塑造胰腺癌免疫微环境中发挥关键作用。本文中我们表明，Lin28b+癌症相关成纤维细胞有助于在胰腺导管腺癌中建立免疫冷肿瘤微环境。机制上，Lin28b直接结合STING mRNA并促进其降解，从而抑制STING表达及下游I型干扰素信号。癌症相关成纤维细胞中Lin28b缺失激活cGAS-STING-干扰素信号级联，增强树突状细胞抗原提呈和CD8+ T细胞细胞毒功能。重要的是，癌症相关成纤维细胞中Lin28b的遗传抑制增强了对anti-PD-L1免疫检查点阻断治疗的敏感性。这些发现揭示，靶向Lin28b-STING轴代表一种有前景的治疗策略，用于克服胰腺导管腺癌对免疫治疗的内在耐药性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CAF中Lin28b如何塑造胰腺癌免疫抑制微环境并影响免疫治疗耐药。
- 核心机制
- Lin28b直接结合STING mRNA并促进其降解，抑制STING-TBK1-IRF3-I型IFN信号，导致免疫冷微环境。
- 主要证据
- CAF特异性Lin28b敲除小鼠中CD8+ T细胞浸润和GZMB/IFNγ升高、肿瘤负荷下降；RIP-seq/RIP-qPCR和RNA pull-down证实Lin28b结合STING mRNA；STING双敲逆转上述免疫效应并削弱α-PD-L1疗效。
- 研究意义
- 靶向Lin28b-STING轴可能克服PDAC对免疫检查点阻断的内在耐药性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Lin28b缺失对CAF内在I型IFN产生的调控
验证Lin28b是否在CAF中抑制I型IFN和ISG表达。
用15376T-CM、KPC-CM或hPDAC-CM诱导CAF 6天，检测Ifna/Ifnb1及Isg15/Cxcl10；用RAWISG报告系统检测上清I型IFN活性；用Wnt5a-KO CM和重组Wnt5a处理验证上游。
Lin28b直接结合并降解STING mRNA的机制验证
阐明Lin28b抑制STING表达的分子机制。
在过表达Flag-Lin28b-WT或RNA结合缺陷突变体的CAF中进行RIP-seq和RIP-qPCR；用缺失GGAGA基序的STING mRNA做RNA pull-down；放线菌素D追踪STING/cGAS mRNA稳定性；检测p-TBK1/p-IRF3。
STING/cGAS对Lin28b缺失CAF免疫效应的必要性验证
确定cGAS-STING通路是否介导Lin28b缺失引起的IFN和抗肿瘤免疫。
构建Lin28b/STING双敲和Lin28b/cGAS双敲CAF，检测p-TBK1、IFN活性和ISG；用STING抑制剂C-176处理；在Fsp-Cre;Lin28bfl/fl;STINGfl/fl小鼠中评估肿瘤生长、生存和免疫浸润。
Lin28b缺失CAF增强ICB疗效及IFN/CD8依赖性验证
检验靶向Lin28b是否克服PDAC对anti-PD-L1耐药，并验证IFN和CD8+ T细胞必要性。
在WT和Fsp-Cre;Lin28bfl/fl小鼠中给予α-PD-L1或同型对照；在Fsp-Cre;Lin28bfl/fl;STINGfl/fl及Wnt5a-KO肿瘤中评估α-PD-L1反应；用α-IFNAR1或α-CD8α联合α-PD-L1阻断。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11995065 |
| 胎牛血清 | Gibco | A5256501 | |
| 胎牛血清 | Vivacell | C04001 | |
| MCF10A完全培养基 | Procell | CM-0525 | |
| CAF分离 | VIII型胶原酶 | Sigma | C2139 |
| 中性蛋白酶II | Sigma | 4942078001 | |
| 胰蛋白酶抑制剂 | Sigma | T6522 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | NEB | M0303S | |
| 质粒构建 | 快速定点突变试剂盒 | Vazyme | C215-01 |
| 病毒转染 | 聚凝胺 | MACGENE | MC032 |
| 流式细胞术 | Foxp3/转录因子固定破膜浓缩液与稀释液试剂盒 | Thermo Fisher | 00-5521-00 |
| 可固定活性染料eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific | 65-0865-14 | |
| BMDC培养 | 小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | BioLegend | -- |
| 共培养 | Transwell小室 | Corning | 3470 |
| T细胞分离 | EasySep小鼠CD8+ T细胞分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | 19858 |
| ELISA | 小鼠IFNβ ELISA试剂盒 | Thermo Scientific | 424001 |
| 多重免疫组织化学 | 六重免疫组化试剂盒 | AiFang Biological | AFIHC036 |
| RIP | RNA免疫沉淀实验试剂盒 | MBL | RN1001 |
| HALT蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | 78430 | |
| 二硫苏糖醇 | Solarbio | D107 | |
| RNA酶抑制剂 | Solarbio | R8061 | |
| Dynabeads蛋白A/G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 80105 G | |
| RNA pull-down | Pierce磁珠RNA-蛋白pull-down试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 20164 |
| T7高产率RNA转录试剂盒 | Beyotime | R7018S | |
| Pierce RNA 3′端脱硫生物素标记试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 20163 | |
| 药物处理 | 多西环素 | Selleck | S5159 |
| 2’,3’-双脱氧胞苷 | Selleck | S1719 | |
| 布雷菲德菌素A | Selleck | S7046 | |
| 离子霉素 | Solarbio | II2200 | |
| OVA肽257-264 | MedChemExpress (MCE) | HY-P1489 | |
| C-176 | MedChemExpress (MCE) | HY-112906 | |
| 佛波酯 | Sigma | 16561-29-8 | |
| 转染 | 干扰素刺激DNA | InvivoGen | tlrl-isdn |
| 聚肌胞苷酸 | InvivoGen | tlrl-picw | |
| 聚脱氧腺苷-脱氧胸苷酸 | InvivoGen | tlrl-patn | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 | |
| 免疫荧光/多重免疫组化 | 抗Lin28b抗体 | Abcam | ab191881 |
| 抗Lin28b抗体 | Abcam | ab289978 | |
| 抗Lin28b抗体 | Proteintech | 16178-1-AP | |
| 抗CK19抗体 | Proteintech | 10712-1-AP | |
| 抗CK19抗体 | Immunoway | YM3051 | |
| 抗PDPN抗体 | Invitrogen | 14-5381-82 | |
| Western blot | 抗STING抗体 | Cell signaling technology | 13647 |
| 抗磷酸化STING抗体 | Cell signaling technology | 72971 | |
| 抗磷酸化STING抗体 | Cell signaling technology | 19781 | |
| 抗TBK1抗体 | Cell signaling technology | 3504 | |
| 抗磷酸化TBK1抗体 | Cell signaling technology | 5483 | |
| 抗IRF3抗体 | Cell signaling technology | 4302 | |
| 抗磷酸化IRF3抗体 | Cell signaling technology | 4947 | |
| 抗CD8α抗体 | Abcam | ab237709 | |
| 抗CD8α抗体 | Abcam | ab217344 | |
| 抗Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 抗ACTIN抗体 | ABclonal | AC026 | |
| 流式细胞术 | 抗CD45-PE/Cyanine7流式抗体 | Invitrogen | 25-0451-81 |
| 抗CD3-AlexaFluor 700流式抗体 | Invitrogen | 56-0032-82 | |
| 抗CD11b-PerCP/Cyanine5.5流式抗体 | Invitrogen | 45-0112-82 | |
| 抗CD8α-APC/Cyanine7流式抗体 | BioLegend | 100714 | |
| 抗颗粒酶B-Brilliant Violet 421流式抗体 | BioLegend | 396414 | |
| 抗IFNγ-Brilliant Violet 605流式抗体 | BioLegend | 505840 | |
| 抗IFNAR1-APC流式抗体 | BioLegend | 127313 | |
| 抗CD45-AlexaFluor 647流式抗体 | BioLegend | 103124 | |
| 抗CD326/EpCAM-AlexaFluor 488流式抗体 | BioLegend | 118212 | |
| 抗CD31-AlexaFluor 647流式抗体 | BioLegend | 102416 | |
| 抗PDPN-APC/Cy7流式抗体 | BioLegend | 127418 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 原位移植肿瘤模型 | 15376T细胞2×10^4/只；共注射时CAF 1×10^5/只；胰腺原位注射体积20 µL；第21天取瘤称重；饮水中doxycycline 2 g/L加蔗糖20 g/L 阅读提示：Methods Xenografts；Fig. 1A–I、Fig. 5G–O图注 |
| CAF中Lin28b诱导 | 肿瘤CM与CAF培养基1:1混合，处理6天，每日更换CM；重组Wnt5a 100 ng/ml处理6天 阅读提示：Methods Conditioned medium and Lin28b induction；Fig. 3N–P图注 |
| 体内抗体处理 | α-IFNAR1 250 µg/次；α-PD-L1 200 µg/次；α-CD8α、α-NK1.1、α-Ly6G均为200 µg/次；腹腔注射；给药时间点文中以“indicated timepoints”描述 阅读提示：Methods In vivo antibody treatment；Fig. 6A–P图注 |
| 流式细胞术检测CD8+ T细胞效应分子 | 检测GZMB/IFNγ前需PMA 100 ng/ml、ionomycin 1 µg/mL、BFA 10 µg/mL刺激6小时；n=5–6 mice 阅读提示：Methods Flow cytometry；Fig. 1S、Fig. 5N–O图注 |
| STING mRNA稳定性与结合验证 | 放线菌素D处理时间点文中未明确说明；RIP使用15 µg Flag抗体或小鼠IgG；RNA pull-down使用STING-WT与缺失GGAGA基序的STING-MU 阅读提示：Methods mRNA stability analysis、RIP and RIP-seq、RNA pull-down；Fig. 4E–H图注 |