人扁桃体Tfh四阶段多组学图谱构建
获取Tfh分化轨迹各阶段的表观基因组与转录组景观。
从健康成人扁桃体分选Naive、Early Extra-GC Tfh、Late Extra-GC Tfh和GC Tfh四群细胞，进行ATAC-seq、RNA-seq及针对H3K4me3、H3K4me1、H3K27Ac的CUT&RUN。
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统一的网络系统方法揭示滤泡辅助性T细胞分化的核心程序
A unified network systems approach uncovers a core program underlying T follicular helper cell differentiation.
实验完整度
高整合人扁桃体bulk多组学、单细胞、空间转录组及小鼠体内感染模型，并进行IL-12阻断功能验证
主要模型
健康成人扁桃体分选Tfh细胞四阶段 人扁桃体单细胞与空间转录组数据集 小鼠STm感染/NP-CGG免疫模型 小鼠过敏性哮喘淋巴结空间转录组数据集
重点核对
人扁桃体Tfh四阶段分选门控：Naive (CD45RA+CXCR5-PD1-)、Early Extra-GC Tfh (CD45RA-CXCR5+PD1-)、Late Extra-GC Tfh (CD45RA-CXCR5+PD1+)、GC Tfh (CD45RA-CXCR5++PD1++) IL-12中和抗体剂量与时间：负荷剂量200 μg，后续100 μg；起始时间day -1、day 3、day 7或day 11 小鼠模型：B1-8+/- BALB/c，8-16周龄，约5×10^5 CFU STm i.p.，50 μg NP-CGG in alum i.p.，感染/免疫后12天分析 CoreNet构建参数：Taiji p<0.01筛选每数据集top 100 TF，合并152个TF；HotNet2 beta=0.4，P<0.05且>3基因，5次独立运行取交集 流式抗体稀释度：人源抗体1:40；小鼠源抗体按原文各抗体指定稀释度（如CD4-BV605 1:400、CXCR5-PE 1:100）
摘要
表征免疫状态进展背后的多尺度过程对于定义其功能至关重要。这对于功能多样且具有可塑性的免疫细胞（如滤泡辅助性T（Tfh）细胞）尤为重要。在此，我们采用一种多尺度网络系统方法，该方法同时整合了调控相互作用和蛋白质-蛋白质相互作用。该方法整合了多种数据类型，捕获了跨免疫系统组织层次的调控，并重现了已知的Tfh分化驱动因素。此外，我们提出了CoreNet，一个在人类和小鼠之间、跨组织类型和疾病背景保守、且在不同数据模式间一致的核心Tfh基因集。利用CoreNet，我们揭示了NR3C1和白细胞介素（IL）-12在Tfh分化调控中的作用。值得注意的是，IL-12允许Tfh前体细胞分化，但阻断其向生发中心Tfh细胞的分化。总体而言，这项工作阐明了在跨物种和组织中调控Tfh分化的具有未探索作用的网络，同时提供了一个可推广的框架。CoreNet可通过交互式网络服务器访问：https://pitt-csi.shinyapps.io/tfhcorenet/。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 是否存在跨物种、组织与疾病背景保守的Tfh分化核心基因程序，以及IL-12在该分化过程中的阶段特异性作用是什么。
- 核心机制
- IL-12通过STAT4信号允许Tfh前体细胞早期分化，但阻断其向生发中心Tfh细胞终末分化；CoreNet网络整合调控与蛋白互作揭示NR3C1等核心调控因子。
- 主要证据
- 人扁桃体四阶段ATAC-seq、RNA-seq与CUT&RUN多组学网络分析定义CoreNet；单细胞、空间转录组及CITE-seq多数据集验证其保守性与蛋白水平；小鼠STm感染模型中使用IL-12中和抗体证实IL-12阶段特异性抑制GC Tfh形成。
- 研究意义
- 解决了IL-12在Tfh分化中作用的长期争议，为基于IL-12佐剂的疫苗策略提供启示，并提供可推广至其他免疫细胞分化研究的网络框架。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
GRN与PPI网络传播识别核心调控模块
从多组学数据中优先排序驱动Tfh分化的转录因子和蛋白互作模块。
使用Taiji个性化PageRank从表观组与转录组构建GRN并排序TF；使用HotNet2随机游走重启算法将基因中心PPS沿HINT PPI网络传播，识别显著子网络模块。
单细胞与空间转录组跨背景验证CoreNet
检验bulk来源模块在单细胞分辨率、不同组织、疾病和物种中是否一致富集于Tfh。
在人扁桃体多ome图谱、PLWHIV肠道scRNA-seq、小鼠过敏性哮喘淋巴结scRNA-seq及人扁桃体Slide-tag空间数据中，用ssGSEA评估CoreNet-PPI等基因集对Tfh与非Tfh细胞的区分能力，并与SCENIC+、SLIDE及文献基因集比较。
蛋白水平验证CoreNet候选标志物
评估网络衍生标志物是否在蛋白水平反映GC Tfh身份。
利用人扁桃体CITE-seq ADT数据和scProAtlas空间CITE-seq数据，比较GC Tfh与非Tfh CD4+ T细胞的蛋白丰度，并对NR3C1、POU2F2进行留一法验证。
小鼠STm感染模型验证IL-12阶段特异性作用
在体内检验IL-12对Tfh前体与GC Tfh分化的阶段特异性影响。
B1-8+/- BALB/c小鼠给予HK STm对照或STm感染并NP-CGG免疫，在不同时间点开始使用IL-12中和抗体，12天后流式检测总Tfh、GC Tfh和非GC Tfh数量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 人扁桃体流式分选 | 生物素化抗人CD19抗体（克隆HIB19） | BioLegend | 555411 |
| 抗人CD3抗体（克隆SK7） | BioLegend | 344817 | |
| 抗人CD4抗体（克隆OKT4） | BioLegend | 317420 | |
| 抗人CD45RA抗体（克隆H100） | BioLegend | 304122 | |
| 抗人CXCR5抗体（克隆J252D4） | BioLegend | 356920 | |
| 抗人PD1抗体（克隆EH12.2H7） | BioLegend | 329924 | |
| LIVE/DEAD可固定蓝色死细胞染料 | ThermoFisher Scientific | L23105 | |
| 人BD Fc封闭剂 | BD Biosciences | 564219 | |
| CUT&RUN | 抗H3K4me1抗体 | Cell Signaling Technology | 5326 |
| 抗H3K4me3抗体 | Cell Signaling Technology | 9751 | |
| 抗H3K27Ac抗体 | Cell Signaling Technology | 8173 | |
| ATAC-seq | Tn5转座酶 | Illumina | FC-121-1030 |
| 小鼠IL-12阻断 | 抗IL-12抗体（克隆C17.8） | BioXcell | BE0051 |
| 小鼠流式 | CD4-BV605抗体（克隆GK1.5） | BD Biosciences | 563151 |
| CD45R-PerCPCy5.5抗体（克隆RA3-6B2） | Biolegend | 103236 | |
| 链霉亲和素-BUV395 | BD Biosciences | 564167 | |
| FoxP3-FITC抗体（克隆FJK-16s） | Invitrogen/ThermoFisher | 11-5773-82 | |
| CXCR5-PE抗体（克隆2G8） | BD Pharmingen | 551959 | |
| CD90.2-BV421抗体（克隆53-2.1） | Biolegend | 140327 | |
| CD19-BUV395抗体（克隆1D3） | BD Biosciences | 563557 | |
| CD44-BV605抗体（克隆IM7） | BD Biosciences | 563058 | |
| CD95-PECy7抗体（克隆Jo2） | BD Biosciences | 557653 | |
| Ghost Violet 510死细胞鉴别染料 | Tonbo | -- | |
| FoxP3转录因子染色试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| RNA-seq | RNeasy Plus Micro试剂盒 | Qiagen | -- |
| KAPA文库定量试剂盒 | KAPA Biosystems | -- | |
| ATAC-seq | QIAGEN MinElute试剂盒 | QIAGEN | -- |
| QIAGEN PCR纯化试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| 肠道scRNA-seq | Chromium Next GEM单细胞基因表达试剂盒 | 10X Genomics | -- |
| Chromium单细胞5' V1试剂盒 | 10X Genomics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人扁桃体Tfh四阶段分选与多组学 | 四阶段门控定义、每群ATAC-seq起始细胞数50,000、RNA-seq建库方法SMART-Seq2、CUT&RUN抗体货号5326/9751/8173 阅读提示：Methods的Human Flow cytometry and sorting、Bulk RNA-seq and analysis、CUT&RUN、ATAC-seq小节及Fig. 1a |
| CoreNet网络构建与模块筛选 | Taiji p<0.01、每数据集top 100 TF、合并152 TF；HotNet2 beta=0.4、模块P<0.05且>3基因、5次独立运行取交集；PPS距离权重 阅读提示：Methods的Personalized PageRank identification of driver TFs、Calculation of gene-centric peak proximity scores、Network propagation using random walk with restart小节 |
| 单细胞/空间ssGSEA验证 | escape R包参数min.size=2、normalize=FALSE；Cliff's Δ阈值≥0.1且p<0.05；各数据集细胞注释标准 阅读提示：Methods的scRNA enrichment of Tfh cell subnetworks and published datasets、Human spatial datasets小节及Fig. 3、Fig. 5图注 |
| 小鼠STm感染与IL-12阻断实验 | STm剂量约5×10^5 CFU i.p.、NP-CGG 50 μg in alum、抗IL-12负荷200 μg/维持100 μg、起始时间day -1/3/7/11、感染后12天分析、每组n=8-15 阅读提示：Methods的Murine salmonella experiments（Infection, Immunization, and anti-IL-12 Treatment）及Fig. 7c-f图注 |
| 小鼠流式检测Tfh亚群 | 总Tfh CXCR5high PD-1high、GC Tfh CD90low、非GC Tfh CD90high门控；各抗体克隆与稀释度 阅读提示：Methods的Flow cytometry analysis for mouse experiments及Fig. 7d、Supplementary Fig. 9B |
| 蛋白水平CITE-seq验证 | 空间CITE-seq Tfh分类三条件（评分≥85百分位、≥15个CoreNet基因、CD4阳性）；留一法验证NR3C1与POU2F2 阅读提示：Methods的Human Tonsil CITE-seq analysis、Human Tonsil spatial CITE-seq analysis小节及Supplementary Fig. 8 |