SerRS–SIRT2复合物的表达纯化与相互作用验证
获得稳定复合物并确认SerRS与SIRT2之间存在直接相互作用。
在大肠杆菌中共表达SerRS（无标签）与SIRT2（His标签），经Ni-NTA亲和纯化、肝素亲和层析和分子排阻色谱获得复合物；SDS-PAGE和SEC分析复合物形成。
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SerRS与SIRT2之间由代谢物桥接的复合物将NAD⁺代谢与翻译控制偶联
A metabolite-bridged complex between SerRS and SIRT2 couples NAD⁺ metabolism to translation control.
实验完整度
高包含冷冻电镜结构、体外生化、细胞实验、氧化应激模型及HDX-MS等多层级证据
主要模型
重组人SerRS与SIRT2蛋白 HEK293AD细胞 HEK293细胞
重点核对
SerRS K414及SIRT2活性位点残基（F96、Q167、N168、H187、K287）突变对复合物形成的影响 ADPR与NAD⁺浓度对SerRS–SIRT2结合亲和力的影响（质量光度法测定KD） tRNASer对SerRS–SIRT2相互作用的竞争抑制 H₂O₂（0.5 mM）处理时间及PJ34（10 μM）对复合物形成的调控 SIRT2野生型与N168A/H187Y突变体对翻译抑制的差异
摘要
细胞稳态需要代谢网络与翻译网络之间的紧密协调。本文通过人胞质丝氨酰-tRNA合成酶（SerRS）与NAD⁺依赖性去乙酰化酶SIRT2复合物的冷冻电镜结构，鉴定了这两个过程之间的直接分子联系。这种相互作用由NAD⁺代谢物ADP-核糖（ADPR）促进，ADPR在两种酶之间充当分子桥。在SIRT2活性位点内，ADPR与位于柔性催化结构域环上的SerRS残基K414结合。K414的乙酰化对于结合并非必需。在功能上，复合物形成通过阻断底物进入而抑制SIRT2去乙酰化酶活性，而SIRT2的结合通过阻止tRNA结合而抑制SerRS的氨酰化活性。因此，SerRS与SIRT2相互调节，ADPR增强而tRNA减弱它们的相互作用。氧化应激通过PARP1依赖性途径促进这种相互作用，揭示了一个将代谢状态与翻译输出偶联的ADPR响应性调节模块。该调节模块可能在脊椎动物中保守。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SerRS与SIRT2如何相互作用，以及这种相互作用如何影响两者的胞质功能？
- 核心机制
- ADPR作为分子桥结合在SIRT2活性位点并与SerRS K414形成氢键，稳定SerRS–SIRT2复合物；SerRS结合遮挡SIRT2底物结合槽，SIRT2结合则阻断tRNA与SerRS结合，导致相互抑制。
- 主要证据
- 冷冻电镜结构（2:1和2:2复合物）、突变体Co-IP、 mass photometry测定的KD、体外去乙酰化与氨酰化实验、细胞水平α-tubulin K40和H4K16乙酰化检测、酸性胶Northern blot及嘌呤霉素掺入实验。
- 研究意义
- 揭示了ADPR响应性调节模块将NAD⁺代谢与翻译控制偶联，拓展了氨酰-tRNA合成酶的功能范围，并提示该机制在脊椎动物中可能保守。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
冷冻电镜结构解析
确定SerRS–SIRT2复合物的整体架构及相互作用界面。
对纯化的SerRS–SIRT2复合物进行冷冻电镜数据采集、三维分类和重构，解析2:1和2:2复合物结构。
ADPR作为桥接分子的鉴定与验证
确认SIRT2活性位点中的配体为ADPR，并验证其对复合物形成的促进作用。
通过ESI三重四极杆质谱检测共纯化复合物中的配体；利用Ni-NTA pull-down、SEC、BLI和质量光度法比较NAD⁺、ADPR和OAADPR对复合物形成的影响。
关键界面残基的突变分析
鉴定介导SerRS–SIRT2相互作用的关键氨基酸残基。
构建SerRS K414A/R/Q、Q412S、M416A等突变体以及SIRT2 F96A、Q167A、N168A、H187Y、K287A、F235A、F244H/E、S271A等突变体，通过Co-IP和pull-down评估结合能力。
SerRS对SIRT2去乙酰化酶活性的抑制验证
验证SerRS结合是否抑制SIRT2的去乙酰化酶活性。
体外荧光去乙酰化实验检测SIRT2活性；细胞水平检测α-tubulin K40和H4K16乙酰化水平。
SIRT2对SerRS氨酰化活性及全局翻译的抑制验证
验证SIRT2结合是否抑制SerRS的tRNA氨酰化活性并影响蛋白质合成。
体外氨酰化实验检测SerRS活性；酸性胶Northern blot检测细胞内tRNA charging水平；嘌呤霉素掺入实验检测全局翻译。
氧化应激通过PARP1–ADPR通路促进复合物形成
验证氧化应激是否通过PARP1依赖性ADPR产生增强SerRS–SIRT2相互作用。
H₂O₂处理HEK293AD细胞，检测PARP1激活和PAR积累，Co-IP检测SerRS–SIRT2结合，并评估翻译抑制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | pET-28a载体 | -- | -- |
| pET-20b(+)载体 | Novagen | -- | |
| 大肠杆菌BL21(DE3) | -- | -- | |
| M-110L微流化处理器 | Microfluidics | -- | |
| 镍-氮三乙酸柱 | QIAGEN | -- | |
| HiTrap Q HP阴离子交换柱 | GE Healthcare | -- | |
| HiTrap肝素HP亲和柱 | GE Healthcare | -- | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg柱 | GE Healthcare | -- | |
| 冷冻电镜样品制备 | 月桂基麦芽糖新戊二醇 | -- | -- |
| 300目R1.2/1.3 UltraAuFoil金网 | Quantifoil | -- | |
| Pelco辉光放电清洗系统 | TED PELLA, INC. | -- | |
| Vitrobot Mark IV冷冻制样机 | Thermo Fisher | -- | |
| 冷冻电镜数据采集 | Talos Arctica透射电子显微镜 | Thermo Fisher | -- |
| Gatan K2 Summit直接电子探测器 | Gatan | -- | |
| 细胞培养与转染 | pCDNA6-V5/His-C载体 | Life Technologies | -- |
| pFlag-CMV-2载体 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 胎牛血清 | Omega Scientific | -- | |
| 青霉素-链霉素 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 免疫共沉淀与Western blot | 抗Flag抗体 | Cell signaling technology | 8146 |
| 抗V5抗体 | Cell signaling technology | 80076 | |
| 蛋白G偶联琼脂糖珠 | Invitrogen | -- | |
| 抗Flag抗体 | Cell signaling technology | 14793 | |
| 抗V5抗体 | Cell signaling technology | 13202 | |
| 抗聚ADP核糖基化抗体 | Cell signaling technology | 89190 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Cell signaling technology | 3873 | |
| 抗SerRS抗体 | Bosterbio | A00501-1 | |
| 抗SIRT2抗体 | Abcam | ab211033 | |
| Ni-NTA pull-down | 镍珠 | -- | -- |
| 抗SerRS抗体（定制小鼠单克隆抗体24C4） | -- | -- | |
| 生物层干涉术 | Octet RED96系统 | Sartorius | -- |
| HIS1K生物传感器探针 | Sartorius | -- | |
| 质谱分析 | Agilent 6495三重四极杆质谱仪 | Agilent | -- |
| Agilent 1290超高效液相色谱系统 | Agilent | -- | |
| Waters BEH-酰胺柱 | Waters | -- | |
| Thermo Scientific Easy nano LC 1200 | Thermo Scientific | -- | |
| Thermo Scientific Q Exactive Plus质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| Phenomenex Aqua 3 µm C18 125 Å色谱填料 | Phenomenex | -- | |
| SIRT2去乙酰化酶活性检测 | Cyclex SIRT2去乙酰化酶荧光检测试剂盒 | CycLex | -- |
| AGK2 | -- | -- | |
| Tubastin A | -- | -- | |
| 抗乙酰化α-微管蛋白(K40Ac)抗体 | Cell signaling technology | 5335 | |
| 抗H4抗体 | Active motif | 91295 | |
| 抗乙酰化H4K16抗体 | Active motif | 39167 | |
| 氢氘交换质谱 | 固定化胃蛋白酶柱 | Sigma | -- |
| Michrom MAGIC C18AQ捕集柱 | Michrom | -- | |
| Magic C18色谱柱 | Michrom | -- | |
| OrbiTrap Elite质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 体外转录 | HiScribe T7高产率RNA合成试剂盒 | NEB | -- |
| 氨酰化实验 | 氚标记L-丝氨酸 | -- | -- |
| 焦磷酸酶 | Roche | -- | |
| MultiScreen 96孔过滤板 | Merck Millipore | -- | |
| 1450 MicroBeta微孔板闪烁及发光计数器 | PerkinElmer | -- | |
| Northern blot | Amersham Hybond-N+膜 | Amersham | -- |
| HRP-链霉亲和素 | Thermo Scientific | -- | |
| 嘌呤霉素掺入实验 | 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 抗嘌呤霉素抗体 | Abcam | ab315887 | |
| 抗嘌呤霉素抗体 | Millipore Sigma | MABE343 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell signaling technology | 2118 | |
| 抗磷酸化eIF2α抗体 | Cell signaling technology | 9721 | |
| 抗eIF2α抗体 | Cell signaling technology | 9722 | |
| 抗ATF4抗体 | Cell signaling technology | 11815 | |
| 抗磷酸化p70 S6K抗体 | Cell signaling technology | 9234 | |
| 抗p70 S6K抗体 | Cell signaling technology | 2708 | |
| 抗磷酸化4EBP1抗体 | Cell signaling technology | 2855 | |
| 抗4EBP1抗体 | Cell signaling technology | 9644 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SerRS–SIRT2复合物形成与纯化 | 共表达宿主为E. coli BL21(DE3)；SerRS无标签，SIRT2 C端His标签；纯化缓冲液为25 mM HEPES-Na pH 7.5、150 mM NaCl；SEC使用HiLoad 16/600 Superdex 200 pg柱 阅读提示：Methods – Protein expression and purification |
| 冷冻电镜数据采集与重构 | 复合物浓度0.5 mg/mL，添加0.05% LMNG；载网为300目R1.2/1.3 UltraAuFoil Holey Gold；电镜Talos Arctica 200 kV；探测器K2 Summit；总剂量50 e−/Ų；2:1复合物分辨率3.38 Å，2:2复合物3.73 Å 阅读提示：Methods – Sample preparation for cryo-EM；Cryo-EM data acquisition, processing and reconstruction；Supplementary Table 1 |
| ADPR结合与复合物稳定性检测 | BLI使用0.5 mM NAD⁺或ADPR；质量光度法使用10 nM SerRS二聚体和80 nM SIRT2；NAD⁺浓度400 μM–10 mM，ADPR浓度16–400 μM；pull-down中ADPR浓度250 μM，tRNASer 5 μM 阅读提示：Methods – Biolayer interferometry；Mass photometry；Ni-NTA pull-down assay；Fig. 2e–h |
| SIRT2去乙酰化酶活性抑制实验 | 体外反应含1 μM SIRT2、不同比例SerRS、0.8 mM NAD⁺、20 μM Fluoro-Substrate peptide；ADPR预孵育30分钟；细胞实验AGK2 5 μM；Tubastin A 5 μM处理6小时 阅读提示：Methods – Fluorometric SIRT2 deacetylase activity assay；Cell-based SIRT2 deacetylase activity assay；Fig. 3b–g |
| SerRS氨酰化活性与翻译抑制实验 | 氨酰化反应含200 nM SerRS、500 nM SIRT2、5 μM IVT-tRNASer、250或500 μM ADPR；嘌呤霉素10 μg/mL处理30分钟；Northern blot使用5 μg总RNA 阅读提示：Methods – Aminoacylation assay；Puromycin incorporation assay；RNA extraction and acidic gel northern blot；Fig. 4e–j |
| 氧化应激诱导复合物形成 | H₂O₂浓度0.5 mM（Co-IP）或5 mM（PARP1激活检测）；PJ34 10 μM预处理24小时；处理时间0–60分钟；嘌呤霉素掺入在0.5 mM H₂O₂处理30分钟时检测 阅读提示：Methods – Coimmunoprecipitation assays and Western blot analysis；Puromycin incorporation assay；Fig. 6b–e |