构建S19近等基因系与遗传分析
确认S19-g在亚洲稻背景下导致杂种雄性不育及等位基因传递偏分离
以9522为轮回父本、CG14为供体亲本回交获得BC4F2,鉴定出S19-g纯合的SG72;观察9522、SG72及F1的花粉与小穗育性,分析BC4F2群体S19基因型分离并进行正反交
Alternatively spliced killer-protector system confers S19-mediated hybrid male sterility in rice.
包含NIL与F1遗传分析、CRISPR敲除、转基因互补、愈伤组织毒性、原生质体定位、Pull-down、BiFC及进化单倍型分析
亚洲栽培稻9522(S19-s纯合) 非洲栽培稻CG14来源的近等基因系SG72(S19-g纯合) 9522×SG72的F1杂种(S19杂合) BC4F3精细定位群体(约25,000株)
S19基因型在BC4F2群体中的分离比:S19-gS19-g 48.8%、S19-gS19-s 50.1%、S19-sS19-s 1.1%(533株) CRISPR/Cas9分别敲除9个候选基因后检测花粉育性与T1代S19位点分离比 S19A1.1与GFP共表达于9522和SG72愈伤组织,培养3周后统计具GFP信号的愈伤数目(每皿10个,共5皿) tS19A7与tS19A1.2等转基因株系的花粉/小穗育性及T1代分离比 CHX(300 µM)处理原生质体后0、3、6、9 h取样进行免疫印迹检测蛋白稳定性
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确认S19-g在亚洲稻背景下导致杂种雄性不育及等位基因传递偏分离
以9522为轮回父本、CG14为供体亲本回交获得BC4F2,鉴定出S19-g纯合的SG72;观察9522、SG72及F1的花粉与小穗育性,分析BC4F2群体S19基因型分离并进行正反交
将S19定位到候选区间并确定非洲稻特有的候选基因
利用BC4F2初定位、约25,000株BC4F3精细定位,结合花药转录组测序和RT-PCR分析候选基因表达
确定S19介导杂种雄性不育所需的因果基因
在S19杂合背景下利用CRISPR/Cas9分别敲除S19ORF1、S19ORF2及S19A1–S19A7,观察突变体花粉和小穗育性及T1代S19位点分离比
区分S19A1.1与S19A1.2对体细胞和配子的毒性作用
构建天然启动子驱动的S19A1.1和S19A1.2转化载体转入9522;将S19A1.1与GFP共表达于9522和SG72愈伤组织观察GFP信号
检验S19A7是否抵消S19A1的毒性
在SG72中敲除S19A7获得杂合突变体,观察花粉与小穗育性及T1代分离;构建天然启动子驱动的tS19A7转入S19杂合体,检测育性与分离比
验证S19A1与S19A7在遗传上构成一个系统
同时敲除S19A1和S19A7获得双突变体;将S19A1-S19A7或S19A1.2-S19A7基因组片段共转入9522,检测花粉育性与T1代分离比
阐明可变剪接造成的剂量差异如何影响杀手-保护者功能
RT-qPCR与RNA原位杂交检测S19A1.1、S19A1.2和S19A7在根、茎、叶、不同发育时期花药、小孢子和子房中的表达;在原生质体中用CHX处理检测GFP融合蛋白稳定性
确定S19A7抑制S19A1的分子方式
在水稻原生质体中共表达GFP融合蛋白与线粒体标记Mito-mCherry进行定位;用pull-down和BiFC检测S19A7与S19A1.1、S19A1.2的互作
追溯功能性S19位点的起源与进化路径
对多个稻属物种的S19A1/S19da1与S19A7/S19da7进行PCR扩增与单倍型鉴定,结合SG72×HHZ的F2分离分析S19da7功能
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 原生质体分离 | Murashige and Skoog培养基 | PhytoTech Labs | M519 |
| 胚囊染色 | 曙红B | Macklin Biochemical | E808595 |
| 胚囊透明 | 水杨酸甲酯 | Macklin Biochemical | M813577 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| cDNA合成 | 一步gDNA去除与cDNA合成SuperMix试剂盒 | TransGen Biotech | AT311 |
| Pull-down蛋白表达 | 大肠杆菌Transetta (DE3) | TransGen Biotech | CD801-02 |
| Pull-down蛋白重悬 | 磷酸盐缓冲液 | Solarbio | P1032 |
| Pull-down蛋白超声破碎 | VCX150超声破碎仪 | SONICS& MATERIALS | VCX150 |
| 蛋白上样 | 蛋白上样缓冲液 | Solarbio | P1040 |
| Pull-down免疫印迹 | 抗MBP抗体 | TransGen Biotech | HT701 |
| 抗GST抗体 | TransGen Biotech | HT601 | |
| 原位杂交包埋 | Paraplast Plus石蜡 | Sigma-Aldrich | P3683 |
| 原位杂交切片 | Leica RM2245旋转切片机 | Leica | RM2245 |
| 原位杂交探针合成 | DIG RNA标记试剂盒 | Roche | 11175025910 |
| 原位杂交显色 | NBT/BCIP底物 | Sigma-Aldrich | 11681451001 |
| 原位杂交成像 | PreciPoint M8数字切片扫描显微镜 | PreciPoint | M8 |
| 蛋白稳定性分析 | 蛋白提取缓冲液 | Beyotime | P0013 |
| SDS-PAGE上样缓冲液 | Solarbio | P1040 | |
| 蛋白稳定性分析免疫印迹 | 抗GFP抗体 | TransGen Biotech | HT801 |
| 抗mCherry抗体 | Abcam | ab125096 | |
| 单倍型PCR扩增 | Phanta Max超保真DNA聚合酶 | Vazyme | P505 |
| 花粉显微观察 | Axio Observer D1光学显微镜 | Carl Zeiss | Axio Observer D1 |
| 胚囊观察 | Stellaris5共聚焦显微镜 | Leica | Stellaris5 |
| 愈伤组织GFP观察 | Axio Zoom.V16体视显微镜 | Carl Zeiss | Axio Zoom.V16 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| S19遗传分析与图位克隆 | BC4F2群体533株的S19基因型分离比;BC4F3精细定位群体约25,000株;定位区间标记M1509与M1520 阅读提示:Results“Map-based cloning of S19”及Fig. 1b–d、Supplementary Fig. 3、Supplementary Tables 1–3 |
| CRISPR/Cas9敲除与育性表型 | 20 bp sgRNA设计;载体pYLCRISPR/Cas9PUbi-H;敲除突变体T1代S19位点分离比;花粉育性n=5朵花、小穗育性n=3或5个穗 阅读提示:Methods“CRISPR/Cas9 genome editing and genetic complementation”及Figs. 2、3、4图注 |
| S19A1.1愈伤组织毒性检测 | S19A1.1与GFP共表达载体;9522与SG72愈伤组织;含潮霉素B选择培养基培养3周;5皿×10个愈伤的GFP信号统计 阅读提示:Methods“Testing the toxic effects of S19A1 on calli”及Fig. 2d, e |
| 蛋白稳定性分析 | CHX终浓度300 µM;处理后0、3、6、9 h取样;anti-GFP与anti-mCherry抗体稀释比;3次独立重复 阅读提示:Methods“Protein stability analysis”及Fig. 5d–g |
| 互作与定位实验 | 原生质体PEG/Ca2+转染质粒用量;BiFC 28°C暗培养16–20 h;Pull-down 4°C孵育8–10 h及1 mM IPTG诱导条件 阅读提示:Methods“Subcellular localization and BiFC assays”与“Protein pull-down assay”及Fig. 6 |