水稻中可变剪接的杀手-保护者系统介导S19控制的杂种雄性不育

Alternatively spliced killer-protector system confers S19-mediated hybrid male sterility in rice.

作者信息Jintao Tang, Huina Wang, Yaoming Feng, Shunmei Li, Ruiying Liu, Zixu Zhang, Shaotong Chen, Shuangchun Li, Xianrong Xie, Heying Li, Zuofeng Zhu, Yao-Guang Liu, Yongyao Xie, Letian Chen
PMID42414285
发布时间2026-07-08
DOI10.1038/s41467-026-74581-0

实验完整度

高

包含NIL与F1遗传分析、CRISPR敲除、转基因互补、愈伤组织毒性、原生质体定位、Pull-down、BiFC及进化单倍型分析

主要模型

亚洲栽培稻9522(S19-s纯合) 非洲栽培稻CG14来源的近等基因系SG72(S19-g纯合) 9522×SG72的F1杂种(S19杂合) BC4F3精细定位群体(约25,000株)

重点核对

S19基因型在BC4F2群体中的分离比:S19-gS19-g 48.8%、S19-gS19-s 50.1%、S19-sS19-s 1.1%(533株) CRISPR/Cas9分别敲除9个候选基因后检测花粉育性与T1代S19位点分离比 S19A1.1与GFP共表达于9522和SG72愈伤组织,培养3周后统计具GFP信号的愈伤数目(每皿10个,共5皿) tS19A7与tS19A1.2等转基因株系的花粉/小穗育性及T1代分离比 CHX(300 µM)处理原生质体后0、3、6、9 h取样进行免疫印迹检测蛋白稳定性

摘要

杂种不育限制了强种间杂种优势的利用,而S19是导致亚洲栽培稻(Oryza sativa)与非洲栽培稻(Oryza glaberrima)之间杂种不育的一个主要位点。然而,S19尚未被克隆,其潜在机制仍不清楚。在本研究中,我们鉴定出两个紧密连锁的、为非洲稻等位基因所特有的基因(S19A1和S19A7),它们在S19位点编码一个杀手-保护者模块。杀手基因S19A1表达的两个可变剪接转录本(S19A1.1和S19A1.2)编码靶向线粒体的细胞毒性蛋白,分别对体细胞和/或配子细胞死亡造成不同程度的毒性。然而,S19A7与S19A1.1和S19A1.2相互作用,阻断它们的细胞毒性效应。由于亚洲稻S19等位基因缺乏S19A1和S19A7,携带该等位基因的雄配子在亚洲-非洲稻F1杂种中被选择性败育。敲除S19A1可以克服S19介导的杂种不育。单倍型分析表明,功能性S19等位基因在非AA基因组稻属物种中缺失,很可能通过多步骤进化过程在O. barthii–O. glaberrima谱系中出现。我们的发现为亚洲稻与非洲稻之间杂种不育的遗传机制提供了新见解,并为利用水稻种间杂种优势提供了遗传和生物技术策略。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
S19位点导致亚洲栽培稻与非洲栽培稻杂种雄性不育的因果基因及其作用机制是什么?
核心机制
S19A1经可变剪接产生S19A1.1和S19A1.2两个靶向线粒体的细胞毒性杀手蛋白,S19A7与二者互作并抑制其毒性;缺乏S19A1和S19A7的亚洲稻S19-s等位基因雄配子在杂种中被选择性败育。
主要证据
在9522背景中构建携带S19-g的近等基因系SG72并进行图位克隆;CRISPR敲除S19A1恢复花粉育性并消除分离偏分离,敲除S19A7导致半不育;S19A7转基因恢复约75%花粉育性;pull-down与BiFC证实S19A7与S19A1.1、S19A1.2互作;可变剪接导致转录本丰度与蛋白稳定性差异。
研究意义
为亚洲稻与非洲稻杂种不育的遗传机制提供见解,并提示可通过遗传和生物技术策略利用水稻种间杂种优势。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

构建S19近等基因系与遗传分析

确认S19-g在亚洲稻背景下导致杂种雄性不育及等位基因传递偏分离

以9522为轮回父本、CG14为供体亲本回交获得BC4F2,鉴定出S19-g纯合的SG72;观察9522、SG72及F1的花粉与小穗育性,分析BC4F2群体S19基因型分离并进行正反交

2

图位克隆与候选基因鉴定

将S19定位到候选区间并确定非洲稻特有的候选基因

利用BC4F2初定位、约25,000株BC4F3精细定位,结合花药转录组测序和RT-PCR分析候选基因表达

3

CRISPR/Cas9逐个敲除候选基因

确定S19介导杂种雄性不育所需的因果基因

在S19杂合背景下利用CRISPR/Cas9分别敲除S19ORF1、S19ORF2及S19A1–S19A7,观察突变体花粉和小穗育性及T1代S19位点分离比

4

验证S19A1的杀手功能

区分S19A1.1与S19A1.2对体细胞和配子的毒性作用

构建天然启动子驱动的S19A1.1和S19A1.2转化载体转入9522;将S19A1.1与GFP共表达于9522和SG72愈伤组织观察GFP信号

5

验证S19A7的保护者功能

检验S19A7是否抵消S19A1的毒性

在SG72中敲除S19A7获得杂合突变体,观察花粉与小穗育性及T1代分离;构建天然启动子驱动的tS19A7转入S19杂合体,检测育性与分离比

6

双基因敲除与共转化验证杀手-保护者系统

验证S19A1与S19A7在遗传上构成一个系统

同时敲除S19A1和S19A7获得双突变体;将S19A1-S19A7或S19A1.2-S19A7基因组片段共转入9522,检测花粉育性与T1代分离比

7

表达模式与蛋白稳定性分析

阐明可变剪接造成的剂量差异如何影响杀手-保护者功能

RT-qPCR与RNA原位杂交检测S19A1.1、S19A1.2和S19A7在根、茎、叶、不同发育时期花药、小孢子和子房中的表达;在原生质体中用CHX处理检测GFP融合蛋白稳定性

8

蛋白互作与亚细胞定位验证

确定S19A7抑制S19A1的分子方式

在水稻原生质体中共表达GFP融合蛋白与线粒体标记Mito-mCherry进行定位;用pull-down和BiFC检测S19A7与S19A1.1、S19A1.2的互作

9

进化与单倍型分析

追溯功能性S19位点的起源与进化路径

对多个稻属物种的S19A1/S19da1与S19A7/S19da7进行PCR扩增与单倍型鉴定,结合SG72×HHZ的F2分离分析S19da7功能

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
Murashige and Skoog培养基PhytoTech LabsM519
曙红BMacklin BiochemicalE808595
水杨酸甲酯Macklin BiochemicalM813577
TRIzol试剂Invitrogen--
一步gDNA去除与cDNA合成SuperMix试剂盒TransGen BiotechAT311
大肠杆菌Transetta (DE3)TransGen BiotechCD801-02
磷酸盐缓冲液SolarbioP1032
VCX150超声破碎仪SONICS& MATERIALSVCX150
蛋白上样缓冲液SolarbioP1040
抗MBP抗体TransGen BiotechHT701
抗GST抗体TransGen BiotechHT601
Paraplast Plus石蜡Sigma-AldrichP3683
Leica RM2245旋转切片机LeicaRM2245
DIG RNA标记试剂盒Roche11175025910
NBT/BCIP底物Sigma-Aldrich11681451001
PreciPoint M8数字切片扫描显微镜PreciPointM8
蛋白提取缓冲液BeyotimeP0013
SDS-PAGE上样缓冲液SolarbioP1040
抗GFP抗体TransGen BiotechHT801
抗mCherry抗体Abcamab125096
Phanta Max超保真DNA聚合酶VazymeP505
Axio Observer D1光学显微镜Carl ZeissAxio Observer D1
Stellaris5共聚焦显微镜LeicaStellaris5
Axio Zoom.V16体视显微镜Carl ZeissAxio Zoom.V16

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
S19遗传分析与图位克隆
BC4F2群体533株的S19基因型分离比;BC4F3精细定位群体约25,000株;定位区间标记M1509与M1520
阅读提示:Results“Map-based cloning of S19”及Fig. 1b–d、Supplementary Fig. 3、Supplementary Tables 1–3
CRISPR/Cas9敲除与育性表型
20 bp sgRNA设计;载体pYLCRISPR/Cas9PUbi-H;敲除突变体T1代S19位点分离比;花粉育性n=5朵花、小穗育性n=3或5个穗
阅读提示:Methods“CRISPR/Cas9 genome editing and genetic complementation”及Figs. 2、3、4图注
S19A1.1愈伤组织毒性检测
S19A1.1与GFP共表达载体;9522与SG72愈伤组织;含潮霉素B选择培养基培养3周;5皿×10个愈伤的GFP信号统计
阅读提示:Methods“Testing the toxic effects of S19A1 on calli”及Fig. 2d, e
蛋白稳定性分析
CHX终浓度300 µM;处理后0、3、6、9 h取样;anti-GFP与anti-mCherry抗体稀释比;3次独立重复
阅读提示:Methods“Protein stability analysis”及Fig. 5d–g
互作与定位实验
原生质体PEG/Ca2+转染质粒用量;BiFC 28°C暗培养16–20 h;Pull-down 4°C孵育8–10 h及1 mM IPTG诱导条件
阅读提示:Methods“Subcellular localization and BiFC assays”与“Protein pull-down assay”及Fig. 6