FAO通路不同酶节点对铁死亡敏感性的筛选
确定FAO通路中哪些酶节点抑制能增强肿瘤细胞对铁死亡的敏感性。
在B16F0细胞中分别敲低Cpt1a、Cpt2、Acadl、HADHA和HADHB，用RSL3处理，检测细胞活力、细胞死亡和脂质过氧化。
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脂肪酸氧化通量中断时积累的中间产物促进肿瘤铁死亡并改善免疫治疗
Intermediate accumulated upon interruption of fatty acid oxidation flux promotes tumoral ferroptosis and improves immunotherapy.
实验完整度
高包含多种肿瘤细胞系体外实验、基因敲除/敲低、代谢物补充、小鼠皮下瘤模型、免疫细胞分析及患者样本队列验证。
主要模型
B16F0小鼠黑色素瘤细胞系 TDCL小鼠肺癌细胞系 Panc02小鼠胰腺癌细胞系 A549人肺癌细胞系 C57BL/6小鼠皮下肿瘤模型 M-NSG免疫缺陷小鼠皮下肿瘤模型 肺癌患者组织芯片与血浆样本
重点核对
HADHA敲低或敲除后RSL3诱导的铁死亡敏感性（细胞活力、细胞死亡、脂质过氧化） HADHA E510Q突变体回补后酶活性及铁死亡抵抗的恢复 HADHA缺失细胞线粒体脂质组学中酰基肉碱C18-OH的积累 外源酰基肉碱C18-OH处理对RSL3/ML162诱导铁死亡的增敏效应 HADHA缺失肿瘤在C57BL/6小鼠中的生长抑制及ACSL4缺失的逆转
摘要
靶向癌症代谢的治疗策略正在迅速发展。然而，扰动同一代谢通路中的不同节点往往产生不同的结果。铁死亡是一种由脂质过氧化驱动的代谢性细胞死亡，因能增强抗肿瘤免疫而备受关注。在此，我们证明，在羟酰基辅酶A脱氢酶（HADHA）节点中断脂肪酸氧化（FAO）可促进肿瘤铁死亡，而靶向上游酶则不能。抑制HADHA会导致羟基化C18（C18-OH）酰基肉碱积累，从而加剧线粒体脂质过氧化。在体内，HADHA消融或补充酰基肉碱C18-OH可抑制肿瘤生长、增强抗肿瘤T细胞免疫并增强PD-1阻断疗法。在临床上，血浆酰基肉碱C18-OH升高与肺癌患者更好的预后和免疫治疗反应相关。曲美他嗪是一种已获批的抗缺血药物和HADHA抑制剂，同样可延缓肿瘤进展并增强免疫治疗。总之，我们的发现将HADHA确定为铁死亡调节因子，并提供了一种通过代谢干预增强铁死亡和免疫治疗的临床可行策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FAO通路中不同酶节点对肿瘤铁死亡敏感性有何差异，HADHA抑制是否通过特定代谢中间产物促进铁死亡并增强免疫治疗？
- 核心机制
- HADHA抑制中断FAO通量，导致羟基化C18酰基肉碱（C18-OH）在线粒体积累，加剧线粒体脂质过氧化，从而促进肿瘤铁死亡并增强抗肿瘤CD8+ T细胞免疫。
- 主要证据
- 多种小鼠及人肿瘤细胞系中HADHA敲低/敲除增强RSL3诱导的铁死亡；脂质组学鉴定C18-OH积累；外源C18-OH增敏铁死亡；HADHA缺失肿瘤在免疫健全小鼠中生长受抑且依赖ACSL4；CD8+ T细胞耗竭逆转抗肿瘤效应；TMZ抑制HADHA并增强PD-1阻断疗效。
- 研究意义
- 将HADHA确定为铁死亡调节因子，揭示酰基肉碱C18-OH的促铁死亡功能，并提出利用已获批药物TMZ靶向肿瘤铁死亡以增强免疫治疗的临床可行策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HADHA酶活性依赖性的验证
验证HADHA对铁死亡的调控是否依赖其酶活性。
构建HADHA E510Q突变体，回补至HADHA敲除B16F0细胞，检测酶活性和RSL3诱导的铁死亡。
亚精胺对HADHA酶活性的调控及铁死亡保护作用
探究铁死亡诱导时HADHA酶活性升高的机制及其对铁死亡的影响。
RSL3处理B16F0细胞后检测HADHA酶活性和细胞内亚精胺含量；外源补充亚精胺或抑制亚精胺合成（DFMO、shSRM），检测铁死亡。
HADHA抑制后代谢中间产物的鉴定与功能验证
鉴定HADHA缺失导致积累的代谢中间产物，并验证其促铁死亡功能。
对HADHA缺失B16F0细胞线粒体进行脂质组学分析，发现酰基肉碱C18-OH积累；外源C18-OH处理联合RSL3或ML162，检测细胞死亡、线粒体ROS和脂质过氧化。
HADHA缺失或C18-OH在体内的抗肿瘤及免疫增强效应
验证HADHA缺失或C18-OH补充在免疫健全小鼠中的抗肿瘤效果及免疫依赖性。
将WT或HADHA KO B16F0细胞皮下接种C57BL/6或M-NSG小鼠，观察肿瘤生长；使用ACSL4缺失、CD8/CD4 T细胞清除、抗PD-1抗体等干预；C18-OH腹腔注射联合抗PD-1。
TMZ抑制HADHA的体外及体内抗肿瘤与免疫增强效应
验证已获批药物TMZ是否通过抑制HADHA重现促铁死亡和抗肿瘤免疫效果。
TMZ处理B16F0等细胞检测HADHA酶活性、C18-OH积累和铁死亡；TMZ灌胃给药于TDCL或B16F0荷瘤小鼠，检测肿瘤生长和T细胞浸润；TMZ联合抗PD-1治疗。
临床样本中HADHA表达及血浆C18-OH与预后的关联分析
评估HADHA表达和血浆C18-OH水平与肺癌患者预后及免疫治疗反应的相关性。
对86例肺癌患者组织芯片进行HADHA/HADHB免疫组化；对68例NSCLC患者血浆进行C18-OH LC-MS/MS定量；分析756例肺癌患者TMZ用药记录与生存。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Cegrogen Biotech | -- | |
| 质粒构建 | Phanta Max超保真DNA聚合酶试剂盒 | Vazyme | P505 |
| 慢病毒包装与感染 | LentiCRISPR-V2载体 | Addgene | 52961 |
| pLKO.1载体 | Addgene | 8453 | |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | Sigma | 107689-10 G |
| 脂质过氧化检测 | BODIPY 581/591 C11脂质过氧化探针 | Thermo Fisher Scientific | D3861 |
| 线粒体ROS检测 | MitoSOX红色线粒体超氧化物指示剂 | Yeasen | 40778ES50 |
| RNA提取 | Freezol RNA提取试剂 | Vazyme | R711 |
| 逆转录 | PrimeScript逆转录预混液 | TaKaRa | RR036A |
| qPCR | 2×Rapid Taq预混液 | Vazyme | p222-01 |
| QuantStudio 3实时PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Thermo Fisher Scientific | 89900 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | MedChemExpress | HY-K0010 | |
| BCA蛋白浓度测定试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PVDF膜 | Millipore | 1620177 | |
| ChemiDoc成像系统 | Tanon | 5200Multi | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗Flag抗体 | Sigma | F1804 | |
| 抗HADHA抗体 | Abcam | ab203114 | |
| 抗ACSL4抗体 | Santa Cruz | sc365230 | |
| 抗GPX4抗体 | Proteintech | 67763-1-Ig | |
| 抗αTubulin抗体 | Proteintech | 11224-1-AP | |
| 抗4-HNE抗体 | JaICA | HNEJ-2 | |
| LC-MS/MS | SCIEX Triple Quad 5500+ LC-MS/MS系统 | SCIEX | -- |
| XBridge BEH Amide XP色谱柱 | Waters | -- | |
| 荧光显微镜 | 玻璃底培养皿 | NEST | 801001 |
| MitoTracker深红色线粒体探针 | Yeasen | 40743ES50 | |
| Olympus FV3000激光扫描共聚焦显微镜 | Olympus | -- | |
| HADHA酶活性检测 | 细胞线粒体分离试剂盒 | Beyotime | C3601 |
| 脂质组学 | SCIEX QTRAP 6500+质谱系统 | SCIEX | -- |
| Thermo Accucore C30色谱柱 | Thermo | -- | |
| 酰基肉碱检测 | Agilent 1290 Infinity II超高效液相色谱系统 | Agilent | -- |
| 6470A三重四极杆质谱仪 | Agilent | -- | |
| Waters BEH C18色谱柱 | Waters | -- | |
| MDA检测 | 脂质过氧化MDA检测试剂盒 | Biosharp | BL904A |
| 超声匀浆器 | Jingxin | JXFSTPRP-24 | |
| EggPC自氧化实验 | STY-BODIPY探针 | Cayman Chemicals | 27089 |
| 动物实验 | 曲美他嗪 | Selleck | S4543 |
| 酰基肉碱C18-OH | TRC | H953630 | |
| 抗PD-1抗体 | BioXCell | BE0146 | |
| 抗CD8a抗体（克隆2.43） | Selleck | A2102 | |
| 抗CD4抗体（克隆GK1.5） | Selleck | A2101 | |
| 肿瘤浸润淋巴细胞分析 | 淋巴细胞分离液 | MP Biomedicals | 0850494 |
| Zombie NIR活性染料 | Biolegend | 77184 | |
| 抗CD45抗体 | Biolegend | 30-F11 | |
| 抗CD3抗体 | BD | 562600 | |
| 抗CD4抗体 | Biolegend | GK1.5 | |
| 抗CD8抗体 | Biolegend | 53-6.7 | |
| 固定缓冲液 | Biolegend | 420801 | |
| 通透/洗涤缓冲液 | Biolegend | 421002 | |
| 抗IFNγ抗体 | Biolegend | XMG1.2 | |
| 抗TNFα抗体 | Biolegend | MP6-XT22 | |
| 免疫组织化学 | 兔/鼠一抗免疫组化预检测试剂盒 | Proteintech | 20031553 |
| 抗HADHA+HADHB抗体[4A8BG12] | Abcam | ab110302 | |
| Pannoramic SCAN全自动玻片扫描平台 | 3DHISTECHS | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HADHA敲低/敲除细胞铁死亡敏感性检测 | 细胞系（B16F0、TDCL、Panc02、A549）、shRNA序列、RSL3浓度（0.025-4 μM因细胞而异）、处理时间、检测终点（细胞活力/死亡/脂质ROS） 阅读提示：Methods 质粒构建与基因编辑细胞系建立；Figure 1 图注及 Supplementary Fig. 1 |
| HADHA酶活性检测 | 线粒体分离方法、反应缓冲液组成（50 mM Tris-HCl pH 8.0、50 mM EDTA pH 8.0、1.2 mM NAD+）、底物β-羟基丁酰-CoA浓度（125 μM）、吸光度监测时间（15 min） 阅读提示：Methods HADHA enzyme activity assay |
| 酰基肉碱C18-OH的脂质组学鉴定与外源处理 | 脂质组学样本（HADHA KO B16F0线粒体，n=4）、C18-OH处理浓度（B16F0 20 μM；A549 30 μM）、联合铁死亡诱导剂（RSL3、ML162、IKE）浓度 阅读提示：Methods 脂质组学分析与数据；Figure 3 图注及 Supplementary Fig. 3 |
| 皮下肿瘤模型与药物处理 | 细胞接种量（B16F0 3×10^5/只；TDCL 3×10^6/只）、小鼠品系与周龄（C57BL/6雌性6-8周；M-NSG）、TMZ剂量与途径（30 mg/kg灌胃）、C18-OH剂量与途径（5 mg/kg腹腔）、抗PD-1抗体剂量与频率（100 μg/只每3天）、抗CD8/CD4抗体剂量（160/100 μg/只）、Liproxstatin-1剂量（10 mg/kg） 阅读提示：Methods Animals；Figure 6、7 图注及 Supplementary Fig. 6、7 |
| 临床样本关联分析 | 肺癌患者组织芯片例数（86例）、血浆样本例数（68例NSCLC）、TMZ处方记录例数（756例）、免疫治疗反应评估标准、H score计算方法 阅读提示：Methods Human subject；Immunohistochemistry (IHC)；Figure 5、6、7 图注 |