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        PAR3介导肝细胞增殖、成熟与结构在肝脏发育和再生中的协调

        PAR3-mediated coordination of hepatocyte proliferation, maturation, and architecture in liver development and regeneration.

        作者信息Li Yang, Yu-Heng Zhou, Junya Hayase, Lei Wang, Weiguang Zhang, Erfei Bi, Cheng-Ran Xu
        PMID42285921
        期刊Nat Commun
        发布时间2026-06-12
        DOI10.1038/s41467-026-73856-w
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含小鼠和人类胚胎肝模型、条件性基因敲除、体外肝叶培养、RNA-seq/ATAC-seq、Co-IP/MS及功能验证

        主要模型

        Foxa3-Cre介导的Pard3条件性敲除小鼠 Foxa3-Cre介导的Yap条件性敲除小鼠 人胚胎肝叶外植体培养 Can 10大鼠肝细胞系

        重点核对

        Pard3-KO小鼠在E15.5和E17.5显示BC长度显著缩短，E13.5极性起始无差异 Yap-KO小鼠在E15.5和E17.5显示BC长度显著缩短 MEK抑制剂PD0325901或U0126处理可恢复Pard3-KO肝叶的BC长度 TPPB激活PKC可模拟BC缩短缺陷 Pard3/Iqgap1双敲低降低p-ERK1/2水平但BC长度未恢复

        摘要

        肝脏协调细胞增殖、极化与成熟同结构组装的能力是其代谢功能和再生能力的基础。然而，整合这些过程的机制尚不完全清楚。利用小鼠和人类模型，我们发现肝脏极性和胆小管（BC）形成起始于肝母细胞阶段的细胞分裂位点，并且BC伸长在时间上与肝细胞分化过程中的定向细胞分裂相关。该过程涉及PAR3和YAP依赖性的ERK/MAPK信号调节。PAR3形成一个蛋白复合物，将一部分IQGAP1定位到紧密连接，从而限制ERK/MAPK在基底外侧膜的激活。这种调节是有效BC伸长和肝细胞成熟所必需的。总之，这些发现揭示了一种阶段依赖性的机制，将肝脏结构与功能成熟联系起来，并为肝脏发育、再生以及代谢性肝病和肝衰竭的潜在治疗策略提供了见解。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        肝脏发育和再生过程中，细胞增殖、极性和结构组装如何协调以促进肝细胞成熟和胆小管形成？
        核心机制
        PAR3通过与IQGAP1形成蛋白复合物将其部分定位到紧密连接，限制IQGAP1在基底外侧膜的可用性，从而抑制ERK/MAPK信号激活；YAP也参与该通路。ERK/MAPK抑制是BC伸长和肝细胞成熟所必需的。
        主要证据
        小鼠和人类胚胎肝组织的免疫荧光显示BC形成与细胞分裂相关；Pard3或Yap条件性敲除导致BC伸长缺陷、肝细胞成熟延迟和增殖增加；scRNA-seq和ATAC-seq显示MAPK通路激活；MEK抑制剂可 rescue BC长度；Co-IP/MS鉴定PAR3-IQGAP1相互作用。
        研究意义
        揭示了阶段依赖性的机制，将肝脏结构与功能成熟联系起来，为肝脏发育、再生以及代谢性肝病和肝衰竭的潜在治疗策略提供见解，并可能改善多能干细胞来源肝细胞样细胞的分化方案。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        肝脏极性和BC发育的时空分析

        确定小鼠和人类肝脏发育中肝细胞极性和BC形成的起始及动态变化

        对E11.5至P60小鼠和W5至W14人胚胎肝切片进行HNF4A、ZO1、MDR1免疫荧光染色，定量极化细胞比例和BC形态；3D重建BC网络；AURKB染色标记分裂细胞。

        2

        PAR3在BC伸长和肝细胞成熟中的功能验证

        检验PAR3缺失对肝细胞极性和BC形成的影响

        构建Foxa3-Cre和Alfp-Cre介导的Pard3条件性敲除小鼠，进行ZO1/MDR1免疫荧光、透射电镜、scRNA-seq（Smart-seq3）、ATAC-seq和Ki67增殖分析；体外肝母细胞分化实验。

        3

        YAP与PAR3相互作用及Yap敲除表型分析

        探究YAP在BC伸长和肝细胞发育中的作用及其与PAR3的关系

        对E17.5 WT和Pard3-KO肝细胞进行PAR3 Co-IP/MS；构建Foxa3-Cre介导的Yap条件性敲除小鼠，进行BC形态、scRNA-seq、ATAC-seq和Ki67分析；比较Pard3-KO、Yap-KO和双KO表型。

        4

        ERK/MAPK信号在BC伸长和肝细胞成熟中的作用

        验证PAR3是否通过抑制ERK/MAPK信号调控BC伸长和肝细胞成熟

        Western blot检测p-ERK1/2水平；E15.5肝叶体外培养并用TPPB（PKC激活剂）、PD0325901或U0126（MEK抑制剂）处理；scRNA-seq和ATAC-seq分析转录和染色质可及性变化；Can 10细胞中Pard3敲低和U0126处理。

        5

        IQGAP1-ERK信号和肌动蛋白细胞骨架机制解析

        阐明PAR3如何通过IQGAP1调控ERK/MAPK信号及细胞骨架

        IQGAP1 Co-IP/MS比较WT和Pard3-KO；免疫荧光检测IQGAP1和RAF1定位；Can 10细胞中Pard3/Iqgap1双敲低及p-ERK1/2检测；GFP-PAR3回补实验；肝叶培养用Y27632或Cytochalasin D处理；ERK1/2 Co-IP/MS。

        6

        ERK/MAPK通路在人类肝发育中的保守性验证

        检验ERK/MAPK信号是否同样调控人类肝细胞发育和BC伸长

        W7-8人胚胎肝叶体外培养2天，TPPB或PD0325901处理，ZO1免疫荧光定量BC长度；FACS分离EpCAM+肝细胞进行scRNA-seq，投影到人类肝母细胞-肝细胞发育轨迹。

        7

        PAR3在肝脏再生中的作用

        探究PAR3在成年肝脏再生过程中对BC结构和肝细胞增殖的调控

        对成年Pard3-f/f小鼠注射AAV8-Tbg-Cre诱导敲除，4周后行70%肝切除，在基线、术后2天、7天和6周分析肝脏/体重比、BC形态、scRNA-seq、血清ALT/AST、Ki67和p-ERK1/2。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        免疫荧光染色透射电子显微镜共聚焦成像三维重建
        验证细胞功能变化
        Ki67染色体外肝母细胞分化实验集落形成实验
        验证分子表达变化
        逆转录定量PCR蛋白质印迹免疫共沉淀质谱分析
        验证机制链路
        siRNA介导的敲低慢病毒过表达离体肝叶培养药理学抑制
        评估体内效果
        条件性敲除小鼠模型70%肝切除术AAV8-Tbg-Cre递送血清ALT和AST测定
        数据分析与统计
        Smart-seq3单细胞RNA测序ATAC测序主成分分析拟时序分析基因本体富集分析差异基因表达分析基序富集分析

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        免疫荧光抗HNF4A抗体Santa Cruz Biotechnologysc-6556
        抗ZO1抗体Invitrogen61-7300
        抗MDR1抗体Santa Cruz Biotechnologysc-55510
        抗PAR3抗体Abcamab64646
        抗AURKB抗体Santa Cruz Biotechnologysc-25426
        抗Ki67抗体Thermo Fisher Scientific14-5698-80
        抗IQGAP1抗体Proteintech22167-1-AP
        抗RAF1抗体Proteintech26863-1-AP
        抗β-catenin抗体Cell Signaling Technology37447
        Alexa Fluor 488驴抗山羊二抗Thermo Fisher ScientificA-11055
        Alexa Fluor 594驴抗兔二抗Thermo Fisher ScientificA-21207
        Alexa Fluor 647驴抗小鼠二抗Thermo Fisher ScientificA-31571
        DAPISigmaD9564
        Western blotting抗磷酸化ERK1/2抗体Cell Signaling Technology4370
        抗ERK1/2抗体Proteintech11257-1-AP
        山羊抗兔IgG-HRPBio-Rad170-6515
        Co-IPProtein A DynabeadsInvitrogen10002D
        质谱Orbitrap Exploris 480质谱仪Thermo Fisher Scientific--
        肝叶培养TPPBCalbiochem508158
        PD0325901SelleckS1036
        U0126Sigma-AldrichU120
        Y27632SelleckS1049
        细胞松弛素DSelleckS8184
        细胞培养Ham's F-12K (Kaighn's)培养基Thermo Fisher Scientific21127022
        siRNA转染Lipofectamine RNAi MAX转染试剂Thermo Fisher Scientific13778150
        慢病毒包装Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015
        慢病毒浓缩Lenti-X浓缩试剂Takara Bio631231
        RT-qPCRRNAprep Pure微量RNA提取试剂盒TiangenDP420
        HiScript II Q RT SuperMixVazymeR223-1
        2× M5 HiPer SYBR Premix EsTaqMei5 BiotechnologyMF787-01
        FACS抗小鼠DLK-FITC抗体MBL InternationalD187-4
        抗人EpCAM-APC抗体BioLegend324208
        BD FACSAria Fusion细胞分选仪BD Bioscience--
        scRNA-seqTruePrep DNA文库构建试剂盒VazymeTD501
        ATAC-seqTruePrep DNA文库构建试剂盒VazymeTD502
        血清检测丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒Nanjing Jiancheng Technology Co., Ltd.C009-2-1
        天冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒Nanjing Jiancheng Technology Co., Ltd.C010-2-1

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        小鼠基因敲除模型构建
        Cre品系（Foxa3-Cre或Alfp-Cre）、Pard3-f或Yap-f等位基因、敲除效率验证
        阅读提示：Methods中Mice小节及Supplementary Fig. 3a,4a
        肝叶体外培养与药物处理
        TPPB 0.5 µM、PD0325901 0.5 µM、U0126 10 µM、Y27632 1 µM、Cytochalasin D 0.5 µM；培养时间2天
        阅读提示：Methods中Liver lobe culture小节
        Can 10细胞siRNA敲低
        siRNA序列、转染试剂和用量（4.8 pmol siRNA，Lipofectamine RNAi MAX）、敲低时间72小时
        阅读提示：Methods中siRNA-mediated knockdown in Can 10 cells小节
        70%肝切除再生模型
        麻醉剂三氯乙醇剂量1 g/kg、切除肝叶（中叶和左外叶）、术后时间点（2天、7天、6周）
        阅读提示：Methods中70% hepatectomy小节
        scRNA-seq和ATAC-seq
        Smart-seq3建库试剂、测序平台、数据分析参数（Seurat v4.4.0等）
        阅读提示：Methods中Single-cell RNA-seq、ATAC-seq及数据分析小节

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