临床样本中TXNDC5表达与预后分析
评估TXNDC5在结直肠癌中的临床相关性及细胞定位
重新分析人CRC芯片数据集GSE21510、GSE39396、GSE103479、GSE63216；对人CRC组织芯片进行IHC和IF共染色，分析TXNDC5与α-SMA、CK19共定位及与纤维化基因相关性
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靶向成纤维细胞TXNDC5解决间质型结直肠癌的肿瘤促纤维增生和PD-1耐药
Targeting fibroblast TXNDC5 resolves tumor desmoplasia and PD-1 resistance in colorectal cancer with mesenchymal traits.
实验完整度
高含人CRC组织与CAF、小鼠AOM/DSS及Apcmin/+模型、成纤维细胞特异性敲除、体外细胞实验、scRNA-seq、CyTOF及机制验证
主要模型
人结直肠癌组织及癌相关成纤维细胞CAF AOM/DSS诱导的小鼠结直肠癌模型 Col1a2-CreERT2;Txndc5fl/fl成纤维细胞特异性敲除小鼠 人结肠成纤维细胞CCD-18co及CRC细胞系HCT116、COLO-320-HSR、NCI-H716
重点核对
成纤维细胞特异性Txndc5敲除（Col1a2-CreERT2;Txndc5fl/fl）与对照Col1a2-CreERT2小鼠的分组及他莫昔芬诱导方案（80 mg/kg腹腔注射，连续4天） AOM/DSS造模方案：8周龄雄性小鼠单次腹腔注射12.5 mg/kg AOM，随后3个周期3.5% DSS饮水5天+14天正常饮水 抗PD-1治疗为200 μg/只腹腔注射隔日一次持续2周，于第16周肿瘤形成后开始 TGFβ1处理人结肠成纤维细胞CCD-18co的浓度10 ng/ml、处理时间48小时 scRNA-seq与CyTOF的样本来源、细胞富集方案及每组小鼠数量（n=6）
摘要
间质型结直肠癌常对免疫治疗耐药，其耐药性主要由癌症相关成纤维细胞介导的纤维化屏障和免疫排斥驱动。本研究表明，TXNDC5是一种在人源和小鼠结直肠癌相关成纤维细胞中上调的蛋白质二硫键异构酶，是该免疫抑制微环境的关键调控因子。机制上，TXNDC5通过稳定成纤维细胞中的TGFβ受体TGFBR1增强TGFβ信号，从而驱动成纤维细胞活化和促肿瘤信号通路。成纤维细胞特异性敲除Txndc5可减轻肿瘤硬度、缓解肿瘤血管压迫、降低瘤内缺氧，同时抑制促肿瘤炎性成纤维细胞极化并增强细胞毒性T细胞募集。这种基质重塑抑制肿瘤生长，并显著使肿瘤对PD-1阻断治疗敏感。我们的发现将TXNDC5–TGFBR1轴确定为恶性微环境中纤维化屏障的关键协调者，并提示靶向成纤维细胞中的TXNDC5可能有助于克服间质型结直肠癌患者的免疫治疗耐药。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TXNDC5是否驱动结直肠癌中CAF活化和肿瘤促纤维增生，并通过重塑免疫微环境促进肿瘤进展和免疫治疗耐药。
- 核心机制
- TXNDC5作为PDI促进TGFBR1正确折叠和稳定，增强TGFβ1-TGFBR1正反馈信号驱动CAF活化和ECM产生；同时TXNDC5通过稳定IL1R1促进iCAF极化，共同形成纤维化和免疫抑制微环境。
- 主要证据
- 人CRC组织芯片和CAF样本显示TXNDC5在基质中随分级升高且与不良预后相关；AOM/DSS模型中成纤维细胞特异性Txndc5敲除减少肿瘤负荷、纤维化和缺氧，增加CD8+ T细胞浸润并使肿瘤对anti-PD-1治疗敏感；体外CHX追踪、Co-IP、PLA和FRET实验证明TXNDC5通过PDI活性促进TGFBR1折叠和稳定。
- 研究意义
- 将TXNDC5–TGFBR1轴确定为恶性微环境纤维化屏障的关键协调者，提示靶向成纤维细胞TXNDC5可能克服间质型结直肠癌的免疫治疗耐药。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
AOM/DSS小鼠模型中TXNDC5表达验证
验证小鼠CRC模型是否重现人CMS4间质型和免疫耐受特征及TXNDC5表达模式
对AOM/DSS诱导和Apcmin/+小鼠肿瘤进行IHC和IF染色，利用Col1a1-GFPTg报告小鼠共定位TXNDC5与胶原产生CAF及各类谱系标志物；分析scRNA-seq数据
全局及成纤维细胞特异性Txndc5敲除的体内功能验证
确定TXNDC5在体内对CRC肿瘤发生、CAF活化和纤维化的贡献及细胞来源特异性
对Txndc5-/-全局敲除小鼠和Col1a2-CreERT2;Txndc5fl/fl成纤维细胞特异性敲除小鼠进行AOM/DSS造模，评估肿瘤负荷、CAF丰度、胶原沉积和TGFβ信号；并在Cdx2-Cre和Cdh5-CreERT2条件敲除小鼠中验证细胞类型特异性；在Apcmin/+背景中验证成纤维细胞特异性敲除效果
TXNDC5调控TGFBR1和TGFβ信号的体外机制验证
明确TXNDC5是否通过TGFBR1调控TGFβ诱导的成纤维细胞活化和ECM产生
在CCD-18co人结肠成纤维细胞中敲低或过表达TXNDC5，给予TGFβ1刺激，检测p-SMAD3、TGFBR1、α-SMA、COL1A1和fibronectin；用shTGFBR1或LY364947抑制TGFBR1验证通路依赖性；分离人CRC CAF与adjNF比较
TXNDC5促进TGFBR1折叠和稳定的机制解析
验证TXNDC5是否通过其PDI活性促进TGFBR1蛋白折叠和稳定
CHX追踪实验检测TGFBR1降解；Co-IP和PLA检测TXNDC5与TGFBR1物理互作；MG132蛋白酶体抑制实验；构建PDI活性缺失的TXNDC5 AAA突变体；FRET折叠实验检测TGFBR1折叠效率
TGFβ1-ER应激-ATF6调控TXNDC5表达的机制验证
确定TGFβ1如何上调成纤维细胞TXNDC5表达
用CMS4 CRC细胞条件培养基处理成纤维细胞，检测TGFB1和TXNDC5表达；用4-PBA抑制ER应激；敲低ATF6；构建含或不含ATF6结合位点的TXNDC5启动子荧光素酶报告质粒
成纤维细胞Txndc5敲除对免疫微环境的重塑
验证CAF中TXNDC5是否通过肿瘤纤维化塑造免疫抑制微环境
对Col1a2-CreERT2和Txndc5cKO小鼠AOM/DSS肿瘤进行IF染色检测CD8+ T细胞、PD-L1、MDSC和Treg；进行免疫细胞富集的scRNA-seq分析免疫亚群组成和功能；CyTOF免疫分型；流式检测外周血和脾细胞排除系统性效应；PBMC来源T细胞与成纤维细胞共培养
TXNDC5驱动纤维化导致血管压迫、缺氧和免疫排斥的验证
阐明TXNDC5介导的促纤维增生如何造成实体应力、灌注不足和缺氧
lectin灌注检测血管灌注；AFM检测肿瘤硬度；pimonidazole染色检测缺氧；HIF1α染色和瘤内乳酸浓度检测；scRNA-seq分析髓系细胞Hif1a和Cd274表达
成纤维细胞Txndc5敲除联合抗PD-1治疗的体内疗效验证
验证靶向CAF TXNDC5是否增敏PD-1阻断治疗
在AOM/DSS诱导第16周肿瘤形成后，给予他莫昔芬诱导成纤维细胞特异性Txndc5敲除，同时给予anti-PD-1或IgG对照治疗2周，评估肿瘤负荷、CAF活化、MDSC、Treg和CD8+GzmB+ T细胞浸润
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白折叠与稳定性
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 偶氮甲烷 | Sigma-Aldrich | A5486 |
| 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | 9011-18-1 | |
| 抗PD-L1抗体 | Leinco Technologies | P372 | |
| 抗IgG同型对照 | Leinco Technologies | R1367 | |
| 哌莫硝唑 | Hypoxyprobe | HP2-100Kit | |
| 荧光标记凝集素 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| 他莫昔芬 | -- | -- | |
| 细胞培养 | 转化生长因子β1 | PeproTech | 100-21C |
| FM培养基 | ScienCell | 2301 | |
| RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31800022 | |
| MEM α培养基 | -- | -- | |
| 组织消化 | 4型胶原酶 | Worthington Biochemical | LS004189 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596018 |
| cDNA合成 | Maxima第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K1641 |
| 蛋白定量 | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 |
| Western blot | 细胞裂解液 | Cell Signaling Technology | 9803 |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Omics | C0001 and C0004 | |
| 蛋白上样缓冲液 | Omics | JB06-F002 | |
| WesternBright ECL HRP底物 | Advansta | K-12045-D50 | |
| 抗TXNDC5抗体 | Proteintech | 19834-1-AP | |
| 抗TGFBR1抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-32631 | |
| 抗TGFBR2抗体 | OriGene | TA311643 | |
| 抗磷酸化SMAD3抗体 | Abcam | ab52903 | |
| 抗总SMAD3抗体 | Abcam | ab40854 | |
| 抗纤连蛋白抗体 | BD Biosciences | 610077 | |
| 抗COL1A1抗体 | OriGene | TA309096 | |
| 抗BiP抗体 | Cell Signaling Technology | 3177 | |
| 抗ATF6抗体 | Cosmo Bio | BAM-73-505-EX | |
| 抗IL1R1抗体 | Abcam | ab106278 | |
| 抗β-actin抗体 | OriGene | TA811000 | |
| 抗GAPDH抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-15738 | |
| 免疫组化 | Masson三色染色试剂盒 | Sigma-Aldrich | HT15 |
| 天狼星红 | Abcam | ab246832 | |
| 免疫荧光 | 抗CK19抗体 | Abcam | ab52625 |
| 抗α-SMA抗体 | Abcam | ab5694 | |
| 抗CD11b抗体 | Abcam | ab133357 | |
| 抗VE-cadherin抗体 | Abcam | ab205336 | |
| 抗PD-L1抗体 | Cell Signaling Technology | 64988 | |
| 抗CD8抗体 | Abcam | ab17147 | |
| 抗Gr1抗体 | Abcam | ab25377 | |
| 抗CD4抗体 | Abcam | ab183685 | |
| 抗FOXP3抗体 | Abcam | ab215206 | |
| 抗颗粒酶B抗体 | Abcam | ab255598 | |
| 抗HIF1α抗体 | Novus Biologicals | NB100-479 | |
| 抗Ki67抗体 | Genetex | GTX16667 | |
| 抗B220抗体 | Biolegend | 103202 | |
| DAPI封片剂 | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| 免疫共沉淀 | Pierce磁珠蛋白A/G免疫沉淀试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88804 |
| 邻位连接实验 | Duolink原位邻位连接实验试剂盒 | Sigma Aldrich | DUO92002-30RXN, DUO92004-30RXN, DUO92008-30RXN |
| 抗TGFBR1抗体 | Abnova | H00007046-A01 | |
| 细胞增殖 | 细胞增殖ELISA BrdU试剂盒 | Roche | 11647229001 |
| 荧光素酶报告 | Luc-Pair双荧光素酶检测试剂盒2.0 | GeneCopoeia | LF001 |
| 流式细胞术 | Cytofix/Cytoperm固定透化试剂盒 | BD Biosciences | 554714 |
| FOXP3染色缓冲液套装 | Thermo Fisher Scientific | 00-5523-00 | |
| 抗CD3抗体 | Biolegend | 300405 | |
| 抗CD8抗体 | Biolegend | 344707 | |
| 抗CD4抗体 | Biolegend | 317408 | |
| 抗CD25抗体 | Biolegend | 356132 | |
| 抗PD-1抗体 | Biolegend | 329922 | |
| 抗颗粒酶B抗体 | Biolegend | 372214 | |
| 抗FOXP3抗体 | Biolegend | 320124 | |
| 单细胞测序 | Chromium单细胞3'试剂盒v2 | 10x Genomics | 120267 |
| Chromium单细胞平台 | 10X Genomics | 1000414, 1000496 and 1000422 | |
| 小鼠肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | |
| CyTOF | 顺铂活性染料 | Sigma-Aldrich | P4394 |
| 抗CD45抗体 | BD Biosciences | 103102 | |
| 抗CD11b抗体 | BioLegend | 101202 | |
| 抗Ly6C抗体 | BioLegend | 128002 | |
| 抗Ly6G抗体 | BioLegend | 127602 | |
| 抗Gr-1抗体 | BioLegend | 108402 | |
| 抗S100A8抗体 | Novus Biologicals | NBP2-25273 | |
| 抗F4/80抗体 | BioLegend | 123143 | |
| 抗CD80抗体 | BioLegend | 104735 | |
| 抗CD86抗体 | BioLegend | 105002 | |
| 抗CD206抗体 | BioLegend | 141702 | |
| 抗Ki67抗体 | BD Biosciences | 556003 | |
| 原子力显微镜 | 抗I型胶原抗体 | Novus Biologicals | NB600-408 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| AOM/DSS结直肠癌造模 | 小鼠品系、性别和周龄；AOM剂量12.5 mg/kg单次腹腔注射；DSS浓度3.5%、每周期5天+14天正常饮水、共3个周期；饮水和体重监测频率 阅读提示：Methods中Mice小节及Fig. 1g图注 |
| 成纤维细胞特异性Txndc5敲除诱导 | 他莫昔芬剂量80 mg/kg、腹腔注射连续4天或隔日一次持续2周；诱导起始时间（6周龄或第16周）；Cre品系Col1a2-CreERT2与对照设置 阅读提示：Methods中Mice小节及Fig. 8a图注 |
| 抗PD-1/PD-L1联合治疗 | 抗体剂量200 μg/只、腹腔注射隔日一次持续2周；治疗起始时间第16周；同型对照IgG；原文方法写anti-PD-L1而结果描述为anti-PD-1，需核对具体抗体及靶点 阅读提示：Methods中Mice小节及Fig. 8a图注 |
| TGFβ1刺激成纤维细胞 | TGFβ1浓度10 ng/ml、处理48小时；CCD-18co细胞代次和培养基；shTXNDC5或TXNDC5过表达效率验证 阅读提示：Methods中Cell lines小节及Fig. 3、Fig. 4图注 |
| TXNDC5调控TGFBR1稳定性实验 | CHX浓度100 μg/mL、检测时间点0、4、8小时；MG132浓度和预处理时间；TXNDC5 AAA突变体构建细节；FRET探针转染48小时 阅读提示：Methods中Protein stability assay、Co-IP、FRET-based protein folding assay小节及Fig. 4图注 |
| 单细胞RNA测序与CyTOF免疫分型 | 肿瘤解离和免疫细胞富集方案；每组小鼠数量n=6；捕获细胞数和测序深度；CyTOF抗体panel和数据分析流程 阅读提示：Methods中10x library preparation and sequencing、Mass cytometry by time-of-flight immunoprofiling小节及Fig. 5、Fig. 6图注 |
| 肿瘤硬度与血管灌注检测 | AFM探针参数（针尖半径65 nm、弹簧常数0.1 N/m）、扫描速率20 Hz、每ROI 10 µm²和每鼠至少3个ROI；lectin 100 μg和pimonidazole 60 mg/kg的注射时间 阅读提示：Methods中Co-axial system of confocal microscopy and atomic force microscopy小节及Fig. 7图注 |