hPSCs来源CCOs的诱导分化
建立具有稳定腔室结构的腔室样心脏类器官。
将hPSCs经多阶段分化，依次加入FGF、BMP4、CHIR99021、LY294002、Activin A、IWP2、胰岛素、PD173074、SB431542和视黄酸等分子，诱导形成CCOs。
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自组装腔室样心脏类器官用于建模心脏腔室形成和心脏毒性评估
Self-assembled chamber-like cardiac organoids for modeling cardiac chamber formation and cardiotoxicity assessment.
实验完整度
高包含体外类器官模型、单细胞转录组、基因敲除功能验证及药物处理功能验证等多个独立证据层级。
主要模型
H9人胚胎干细胞来源的腔室样心脏类器官 H1人胚胎干细胞来源的腔室样心脏类器官 UiPSC来源的腔室样心脏类器官 CRISPR/Cas9基因敲除CCOs（TFAP2B、NR2F2、NR2F1、HAND1、NKX2-5、ETS1）
重点核对
CCOs培养至day 11.5形成单一腔室，day 90.5后仍稳定，成功率95%（N=8，n>600） 免疫荧光证实TNNT2+心肌层在外、CDH5+内皮层在内，形成腔室结构 scRNA-seq显示87.4%细胞为TNNT2+心肌细胞，其中76.2%表达NR2F2、11.5%表达MYL3 AA和RA浓度组合（A4R50、A4R500、A50R500）影响腔室形成时间和稳定性 DOX（5 μM）处理24/48 h导致腔室面积减小、细胞活力降低和LDH释放升高
摘要
人类心脏仍然是生物医学研究的中心焦点，但在体外以结构和功能保真度捕捉早期腔室形态发生仍然具有挑战性。在这里，我们展示了从人类多能干细胞生成腔室样心脏类器官（CCOs），其再现了心脏腔室发育的关键特征。CCO形成由协调的FGF、WNT、BMP、RA和AA信号传导所编排，并受包括HAND1、TFAP2B和NR2F2在内的转录因子调控。这些CCOs表现出稳定的自组织架构，具有心肌层、内皮层和内腔，显示自发收缩和钙瞬变。单细胞转录组学揭示了由WNT2B介导的内皮-心肌细胞相互作用，提示协调的组织模式化。我们进一步验证了RA和AA在调节腔室扩大和稳定性中的重要作用。此外，CCOs能够通过直接可视化药物诱导的变化来高效评估心脏毒性和致畸性。总之，该平台为研究心脏发育、机制研究和药理学筛选提供了稳健的模型。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否从人类多能干细胞生成具有结构保真度的腔室样心脏类器官，并用于研究心脏腔室形成机制和评估心脏毒性？
- 核心机制
- CCOs腔室形成和稳定性由FGF、RA、AA、WNT和BMP信号通路协调调控，并依赖转录因子TFAP2B、NR2F2、HAND1和ETS1；内皮细胞通过WNT2B等信号与心肌细胞相互作用参与组织模式化。
- 主要证据
- 通过调控FGF、RA、AA等信号从hPSCs生成CCOs，经免疫荧光、lightsheet成像、scRNA-seq、bulk RNA-seq、基因敲除和药物处理验证了腔室结构、细胞组成、信号通路依赖性和药物响应。
- 研究意义
- 该平台为研究心脏发育、机制研究和药理学筛选（包括心脏毒性和致畸性评估）提供了稳健的模型。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CCOs腔室结构和细胞组成的表征
验证CCOs是否形成腔室结构及心肌/内皮分层。
通过明场成像、免疫荧光、lightsheet 3D成像和单细胞RNA测序分析腔室形态、TNNT2+心肌层、CDH5+内皮层及细胞类型组成。
FGF信号对腔室形成的调控
探究FGF信号在腔室形态发生中的作用。
在早期分化阶段使用FGFR1抑制剂PD173074或PD166866，以及FGFR4抑制剂H3B-6527处理，观察腔室形成和基因表达变化。
AA和RA浓度对腔室形成和稳定性的影响
确定AA和RA在腔室形成和稳定性中的作用及最佳浓度。
测试三种AA和RA浓度组合（A4R50、A4R500、A50R500），通过明场成像和腔室面积测量评估腔室形成时间、大小和稳定性。
关键转录因子的功能验证
验证TFAP2B、NR2F2、NR2F1、HAND1和NKX2-5在腔室形成中的作用。
利用CRISPR/Cas9生成各转录因子敲除的hESC系，分化形成CCOs后通过明场成像、免疫荧光和搏动率测量评估腔室形态和功能。
心脏毒性和致畸性药物评估
验证CCOs平台用于心脏毒性和致畸性筛选的可行性。
使用ISO、DOX、DNR、沙利度胺、阿维A酸和阿司匹林处理CCOs，通过明场成像、运动分析、钙成像、CCK-8、LDH释放和qPCR评估药物效应。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | mTeSR1培养基 | Stemcell Technologies | 85850 |
| 基质胶 | Corning | 354230 | |
| TrypLE Express酶 | Thermo Fisher | 12563029 | |
| Accutase细胞消化液 | Stemcell Technologies | 07920 | |
| Y-27632 | TargetMol | T1725 | |
| 类器官培养 | 超低吸附U型底96孔板 | Corning | 7007 |
| 超低吸附U型底96孔板 | Thermo Fisher | 174929 | |
| 类器官分化 | IMDM培养基 | Gibco | 12440053 |
| F-12营养混合物 | Thermo Fisher | 11765054 | |
| 转铁蛋白 | Sigma-Aldrich | T8158 | |
| 单硫代甘油 | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | SRE0098 | |
| 人BMP4 | R&D systems | 314-BP-500 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Peprotech | 100-18B | |
| 激活素A | Peprotech | 120-14-1000 | |
| CHIR99021 | Tocirs | 4423 | |
| LY294002 | Selleck | S1105 | |
| IWP2 | Selleck | S7085 | |
| SB431542 | Selleck | S1067 | |
| PD-173074 | AbMole | M1875 | |
| H3B-6527 | Macklin | H881517 | |
| 视黄酸 | Selleck | S1653 | |
| 胰岛素 | Selleck | S6955 | |
| 基因敲除筛选 | 嘌呤霉素 | Beyotime | ST551 |
| 免疫荧光 | O.C.T.包埋剂 | Sakura | 4583 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 封闭液 | Beyotime | P0102 | |
| 一抗稀释液 | Beyotime | P0103 | |
| 二抗稀释液 | Beyotime | P0108 | |
| DAPI | Abcam | ab104139 | |
| HAND1抗体 | R&D Systems | AF3168 | |
| HAND1抗体 | Genetex | GTX56230 | |
| NKX2-5抗体 | CST | 8792 | |
| WT1抗体 | Abcam | ab89901 | |
| VIM抗体 | CST | 5741S | |
| VE-cadherin/CDH5抗体 | CST | 2500S | |
| TNNT2抗体 | Abcam | ab8295 | |
| NR2F2抗体 | R&D Systems | PP-H7147-00 | |
| CASP3抗体 | CST | 9961 T | |
| Ki-67抗体 | BD Bioscience | 556003 | |
| NR2F2抗体 | Abcam | ab211777 | |
| MYL3抗体 | Abcam | ab108923 | |
| LAMA2抗体 | Thermo Fisher | PA549929 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Beyotime | A0216 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Beyotime | A0208 | |
| HRP标记的驴抗山羊IgG | Beyotime | A0516 | |
| 钙成像 | Fluo-4 AM钙指示剂 | Beyotime | S1060 |
| Pluronic F-127 | Beyotime | St501 | |
| 玻璃底培养板 | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂 | Beyotime | C0038 |
| 细胞毒性检测 | LDH释放检测试剂盒 | LabLead | L0117 |
| RNA提取 | RNA-easy提取试剂 | Vazyme | 701 |
| RT-qPCR | HiScript II Q逆转录预混液 | Vazyme | R222 |
| ChamQ SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711 | |
| 单细胞解离 | STEMdiff心肌细胞解离试剂盒 | Stemcell Technologies | 05025 |
| 电生理 | Axopatch 700 A放大器 | Axon Instruments | -- |
| Digidata 1550B数模转换器 | Axon Instruments | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CCOs诱导分化 | 各阶段小分子和生长因子浓度及处理时间（FGF 30 ng/mL、BMP4 3 ng/mL、CHIR99021 5 μM、LY294002 5 μM、Activin A 10 ng/mL、IWP2 5 μM、PD173074 0.5 μM、SB431542 0.5 μM、RA 0.5 μM、胰岛素10 μg/mL）；PD173074在24 h后去除 阅读提示：Methods 'Generation of self-assembled chamber-like cardiac organoids'及Fig. 1b |
| AA和RA浓度优化 | AA和RA浓度组合（A4R50、A4R500、A50R500）及最终选择A10R500的依据 阅读提示：Results 'Activin A and RA are essential for chamber formation or stability'及Fig. 4 |
| 基因敲除CCOs | sgRNA序列、敲除细胞系来源（H1或H9）、转染程序（Nucleofector 2b，program B16）及嘌呤霉素筛选浓度0.1 ng/mL 阅读提示：Methods 'Generation of NR2F2, NR2F1, TFAP2B, ETS1, HAND1 and NKX2-5 knock out cell lines'及Table 1 |
| 心脏毒性药物处理 | ISO 1 μM 30 min、普萘洛尔2.5 μM 30 min预处理、DOX/DNR 5 μM 24/48 h、CCK-8和LDH检测时间点 阅读提示：Methods 'Doxorubicin or daunorubicin treatment for viability and toxicity assays'及Fig. 6 |
| 致畸性药物处理 | 沙利度胺10 μg/mL、阿维A酸50 nM、阿司匹林30 μM，从day 0加入；沙利度胺从day 15.5加入的后期暴露实验 阅读提示：Results 'Drug screening for teratogenicity with CCOs'及Fig. 7 |