级联筛选发现咔唑类苗头化合物
快速发现具有STING抑制活性的小分子骨架。
利用SPR和荧光素酶报告基因实验对内部化合物库（约2000个化合物）进行基于靶标和细胞的级联筛选，发现DDO-8878。
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基于合理设计的咔唑类STING抑制剂用于治疗cGAS-STING通路驱动的炎症性疾病
Rational design of carbazole-based STING inhibitors for treating cGAS-STING pathway-driven inflammatory disorders.
实验完整度
高包含体外细胞模型、共晶结构、蛋白结合实验及两种小鼠疾病模型的功能与机制验证
主要模型
THP1-Dual细胞 RAW-Lucia ISG细胞 Trex1-/-小鼠 顺铂诱导的AKI小鼠
重点核对
DDO-88109在THP1-Dual和RAW-Lucia ISG细胞中的IC50分别为1.76 μM和1.85 μM 共晶结构显示DDO-88109以2:1比例结合STING CDN结合口袋 DDO-88109（15 mg/kg，i.p.）在Trex1-/-小鼠中每日给药4周 顺铂25 mg/kg单次i.p.后1小时开始DDO-88109（5/10/15 mg/kg，i.p.）每24小时重复，72小时检测 SR-717（15 mg/kg，i.p.）刺激后检测血浆IFN-β
摘要
干扰素基因刺激蛋白（STING）是先天免疫通路中的关键衔接蛋白，其异常激活与自身免疫性疾病的发病机制密切相关。尽管STING已成为炎症性疾病有吸引力的治疗靶点，但目前的STING抑制剂仍面临脱靶毒性和结合机制理解有限等挑战。在此，通过基于靶标和细胞的级联筛选及合理设计，鉴定出具有咔唑骨架的DDO-88109作为STING抑制剂，在THP1-Dual和RAW-Lucia ISG细胞中的IC50值分别为1.76 μM和1.85 μM。此外，DDO-88109对hSTING isoforms（WT、HAQ和H232）显示出广泛亲和力，并以良好的选择性抑制cGAS-STING信号通路的激活。结构上，通过共晶结构研究确定DDO-88109以2:1化学计量比占据STING的CDN结合口袋。在TREX1缺陷驱动的自身炎症和顺铂诱导的AKI雄性小鼠模型中，DDO-88109（15 mg/kg）治疗显著减少炎症因子的分泌并改善组织炎症。总之，DDO-88109的发现为基于结构的STING抑制剂合理药物开发建立了范式，为cGAS-STING信号驱动的人类自身免疫性疾病提供了潜在的小分子治疗药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过合理设计发现靶向STING CDN结合口袋的高效低毒小分子抑制剂，并验证其对cGAS-STING通路驱动炎症性疾病的治疗潜力。
- 核心机制
- DDO-88109以2:1化学计量比竞争性占据STING的CDN结合口袋，使STING维持非活性构象，从而抑制cGAS-STING通路下游的信号转导。
- 主要证据
- 共晶结构、SPR、ITC、TSA、CETSA和荧光偏振实验证实靶点结合；细胞实验显示DDO-88109抑制STING磷酸化、寡聚化、IRF3二聚化及IFNB/CXCL10转录；Trex1-/-和顺铂诱导AKI小鼠模型中DDO-88109减轻炎症并改善生存。
- 研究意义
- 为基于结构的STING抑制剂合理药物开发建立了范式，并提供针对cGAS-STING信号驱动的人类自身免疫性疾病的潜在小分子治疗药物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
合理设计优化苯环取代基
提高苗头化合物对STING的抑制活性和降低细胞毒性。
基于分子对接和构效关系，对DDO-8878苯环对位取代基进行系统优化，获得DDO-88101。
基于共晶结构的再优化发现DDO-88109
利用DDO-88101与hSTING-CTDWT共晶结构指导进一步结构优化。
解析DDO-88101&hSTING-CTDWT共晶结构，指导咔唑环6位溴取代，获得DDO-88109，并解析其共晶结构。
验证DDO-88109对STING变体的广谱结合与抑制
评估DDO-88109对人群主要STING等位基因变体的结合和功能抑制。
通过TSA、SPR和RT-qPCR检测DDO-88109对hSTING-CTD WT、HAQ、H232变体的结合及对IFNB转录的抑制。
验证DDO-88109对cGAS-STING通路信号转导的选择性抑制
明确DDO-88109对cGAS-STING通路关键信号事件及选择性的影响。
在THP1细胞和THP1衍生巨噬细胞中，用cGAMP、ISD、HT-DNA、CDG、diABZI、SR-717等刺激，检测IFNB/CXCL10转录、蛋白磷酸化、STING寡聚化、IRF3二聚化及STING转位。
评估DDO-88109在小鼠体内的药效
验证DDO-88109在cGAS-STING通路驱动的小鼠炎症模型中的治疗效果。
在SR-717刺激模型、Trex1-/-自身炎症模型和顺铂诱导AKI模型中，通过i.p.给药评估DDO-88109对炎症因子、组织损伤和生存率的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Adamas life | C8016 |
| 胎牛血清 | Vivacell | C04001-500 | |
| 青霉素-链霉素 | gibco | 15140122 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-1 | |
| 杀稻瘟菌素 | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| 嘌呤霉素 | InvivoGen | ant-pr-1 | |
| DMEM培养基 | Adamas life | C8013 | |
| GlutaMAX | gibco | 35050061 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Western blot | 抗GAPDH抗体 | proteintech | 60004-1-Ig |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | proteintech | 66009-1-Ig | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | proteintech | 66031-1-Ig | |
| 抗STING抗体 | Cell Signaling Technology | 13647S | |
| 抗磷酸化STING (S366)抗体 | Cell Signaling Technology | 19781S | |
| 抗TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3504S | |
| 抗磷酸化TBK1 (S172)抗体 | Abcam | ab109272 | |
| 抗IRF3抗体 | Abcam | ab68481 | |
| 抗磷酸化IRF3 (S386)抗体 | Abcam | ab76493 | |
| 抗p65抗体 | Abcam | ab32536 | |
| 抗磷酸化p65 (S536)抗体 | Abcam | ab76302 | |
| 免疫荧光 | 抗钙网蛋白抗体 | Abcam | ab2908 |
| 抗GM130抗体 | Abcam | ab169276 | |
| Alexa FluorTM Plus 405偶联物 | Invitrogen | A48260 | |
| Alexa FluorTM 647偶联物 | Invitrogen | A21244 | |
| 流式细胞术 | Alexa Fluor® 700抗小鼠CD90.2 (Thy1.2)抗体 | Biolegend | 140324 |
| PE抗小鼠CD8a抗体 | Biolegend | 100708 | |
| FITC抗小鼠CD4抗体 | Biolegend | 100510 | |
| Brilliant Violet 421TM抗小鼠CD69抗体 | Biolegend | 104527 | |
| Brilliant Violet 711TM抗小鼠/人CD44抗体 | Biolegend | 103057 | |
| APC/Cyanine7抗小鼠CD62L抗体 | Biolegend | 104428 | |
| 细胞刺激 | 2',3'-cGAMP | BioChemPartner | BCP25157 |
| 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| 动物实验 | SR-717 | BioChemPartner | BCP35417 |
| 细胞刺激 | 洋地黄皂苷 | Targetmol | T2721 |
| 非变性PAGE | 脱氧胆酸钠 | adamas-beta | D6750 |
| 荧光素酶报告基因实验 | QUANTI-Luc | Invivogen | rep-qlc1 |
| 细胞刺激 | ODN 2216 | MCE | HY-150741 |
| 鞭毛蛋白 | TargetMol | TMPJ-00789 | |
| 雷西莫特 | TargetMol | T6964 | |
| C12-iE-DAP盐酸盐 | TargetMol | TP3723 | |
| 胞壁酰二肽 | TargetMol | T16159 | |
| 脂多糖 | MCE | HY-D1056 | |
| 聚肌胞苷酸 | InvivoGen | tlrl-picw | |
| 蛋白纯化 | 镍-次氮基三乙酸琼脂糖珠 | -- | -- |
| Superdex 200 increase 10/300 GL层析柱 | Cytiva | -- | |
| SPR | Series S CM5芯片 | Cytiva | 29104988 |
| 1×HBS-P+运行缓冲液 | Cytiva | BR100671 | |
| Biacore T200仪器 | General Electric Company | -- | |
| ITC | MicroCal PEAQ-ITC自动化等温滴定量热仪 | Malvern Panalytical | -- |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Lumi发光法细胞活力检测试剂盒 | Beyotime | C0065M |
| ELISA | 小鼠IFN-β DuoSet ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY8234-05 |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Renjiebio | RJ16958 | |
| 肌酐比色法检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K188-M | |
| 尿素（BUN）比色法检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K183-M | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013C |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Beyotime | P1045 | |
| Western和IP细胞裂解液 | Beyotime | P0013J | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| 双色SDS-PAGE蛋白上样缓冲液 | Beyotime | P0285 | |
| 非变性PAGE | 非变性凝胶蛋白上样缓冲液 | Beyotime | P0292 |
| RT-qPCR | RNAsimple总RNA提取试剂盒 | TianGen Bio | DP419 |
| HiScript III RT SuperMix (gDNA wiper)试剂盒 | Vazyme | R323-01 | |
| ChamQ SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q341-02/03 | |
| 流式细胞术 | 红细胞裂解液 | Beyotime | C3702 |
| FcR封闭试剂 | Miltenyl Biotec | 130-092-575 | |
| 荧光偏振 | FITC标记的diABZI (GSK-FITC) | -- | -- |
| 热迁移实验 | SYPRO橙色染料 | -- | -- |
| 细胞培养 | THP1-Dual (IRF-Lucia/NF-κB-SEAP)细胞 | Invivogen | thpd-nfis |
| THP1 STING敲除细胞 | Genomeditech | GM-C21621 | |
| RAW-Lucia ISG细胞 | Invivogen | rawl-isg |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 级联筛选与细胞活性测定 | SPR筛选浓度20 μM；THP1-Dual细胞接种密度1×10^5/孔；cGAMP 2 μM和digitonin 5 μg/mL刺激；刺激后3小时检测荧光素酶；n=3生物学重复 阅读提示：Methods中Surface plasmon resonance (SPR) assay和IRF-Lucia luciferase reporter assay小节；Fig. 1c图注 |
| STING结合亲和力测定 | SPR使用Series S CM5芯片，流速30 μL/min，接触90 s，解离120 s；ITC蛋白浓度和化合物浓度、缓冲液含5% DMSO、25°C滴定；TSA和CETSA化合物浓度5 μM 阅读提示：Methods中SPR、ITC、TSA和CETSA小节 |
| 细胞信号通路抑制实验 | THP1细胞4×10^6/孔，化合物预处理12小时，cGAMP 2 μM和digitonin 10 μg/mL刺激2小时；Western blot抗体稀释比例；非变性PAGE脱氧胆酸钠浓度0.5%（STING寡聚化）和0.1%（IRF3二聚化） 阅读提示：Methods中SDS PAGE, native PAGE and immunoblot analysis小节；Fig. 5c-e图注 |
| STING变体结合与功能抑制 | THP1 STING-KO细胞转染WT、HAQ或H232 STING质粒；cGAMP 2 μM刺激；DDO-88109浓度梯度；RT-qPCR检测IFNB；n=3生物学重复 阅读提示：Fig. 4e图注；Methods中RT-qPCR assay小节 |
| Trex1-/-小鼠药效实验 | 4周龄雄性Trex1-/-小鼠，DDO-88109 15 mg/kg i.p.每日给药4周，n=6；H151 15 mg/kg i.p.对照；检测生存率、脾脏重量、流式细胞术T细胞活化 阅读提示：Methods中Animal studies小节；Fig. 7b-f图注 |
| 顺铂诱导AKI小鼠药效实验 | 6周龄雄性C57BL/6J小鼠，顺铂25 mg/kg单次i.p.，1小时后DDO-88109 5/10/15 mg/kg i.p.每24小时重复，72小时后检测，n=6；检测血浆IL-6、肌酐、BUN、H&E和Western blot 阅读提示：Methods中Animal studies小节；Fig. 8a-g图注 |
| SR-717刺激小鼠模型 | 6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠，DDO-88109 5/10/15 mg/kg i.p.，2小时后SR-717 15 mg/kg i.p.，给药3天，n=5；ELISA检测血浆IFN-β 阅读提示：Methods中Animal studies小节；Fig. 6g-h图注 |