报告基因敲入小鼠的构建与验证
建立可全身表达多标签报告蛋白的小鼠模型，用于体内比较不同标签降解剂
利用CRISPR/Cas9将Halo-EGFP-NanoLuc-FKBPF36V（H-E-N-F）报告基因插入ROSA26位点，与广泛表达Cre小鼠杂交去除LoxP-stop盒；通过Western blot、NanoLuc发光和流式检测WBC中报告蛋白表达；检测20种组织器官报告蛋白水平；血常规分析确认无免疫原性
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标签降解剂体内基准测试及其在治疗靶点验证中的应用
The benchmarking and application of tag-degraders in vivo to validate therapeutic targets.
实验完整度
高含报告基因敲入小鼠、两种靶蛋白敲入小鼠及细胞系多层级验证，涵盖组织降解谱、免疫细胞群、药代动力学和安全性评估
主要模型
H-E-N-F报告基因敲入小鼠（ROSA26位点） 65K-Flag-FKBPF36V敲入小鼠 TRAF6-V5-FKBPF36V敲入小鼠 小鼠真皮成纤维细胞（MDF）
重点核对
报告基因小鼠经30 mg/kg腹腔注射标签降解剂，8 h或24 h后检测20种组织器官的NanoLuc发光和Western blot dTAGs（FC1、FV1）或溶剂对照在报告基因小鼠中的单次30 mg/kg腹腔注射，24-96 h时间进程 65K-FKBPF36V小鼠中FV1剂量滴定5、10、20、35 mg/kg，24 h后检测组织降解 65K-FKBPF36V小鼠中FV1 20 mg/kg每日或递减剂量（10、5、2 mg/kg每日或2 mg/kg隔日）持续2周的存活和脾重分析 免疫细胞群分析：报告基因小鼠30 mg/kg dTAGs处理24 h后，取血、脾、骨髓，流式检测B细胞、T细胞、红细胞和髓系细胞中GFP水平
摘要
将候选治疗靶点从实验室研究转化到临床应用需要大量时间和资金投入，然而临床成功率仍然很低，这往往是由于临床前验证阶段对在靶毒性评估不足所致。标签降解剂通过降解标签能够降解任何感兴趣的蛋白质，从而为改善靶点验证提供了一种工具。这种基于药物的、可逆的、剂量依赖性的蛋白质去除方法可以模拟基于降解剂的药物治疗，并评估体内靶蛋白耗竭的影响。然而，每种降解剂具有不同的药代动力学特征，这将影响其在不同组织中的有效性。为了创建一个资源，使研究人员能够选择最合适的标签降解剂，我们在体内对dTAG、HaloPROTAC和NanoTAC系统进行了基准测试，使用表达可被这些标签降解剂靶向的报告蛋白的转基因小鼠。通过各种治疗方案，我们在20种组织和器官中表征了每种降解剂的特性，突出了dTAG分子优越的降解效果，并识别了全组织与单细胞群体之间降解的差异。使用表达65K-FKBPF36V的FKBPF36V敲入小鼠，我们揭示了靶标特异性的降解动力学，以及小鼠中65K的关键需求。总之，这一资源将帮助研究人员为其自身应用选择正确的降解剂和标签。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何在体内系统比较dTAG、HaloPROTAC和NanoTAC三类标签降解剂的降解效果、组织分布和持续时间，并评估标签降解剂用于治疗靶点验证（以65K为例）的可行性及在靶毒性。
- 核心机制
- 标签降解剂通过招募E3连接酶（VHL或CRBN）至degron标签（FKBPF36V、HaloTag7或NanoLuc）诱导靶蛋白泛素化降解；dTAG分子在体内多数组织中降解效率最高，FC1经CRBN、FV1经VHL发挥作用，且降解效果与E3连接酶组织表达水平不完全相关。
- 主要证据
- 在H-E-N-F报告基因敲入小鼠中，FC1和FV1在17/20和15/20的组织中实现50-90%降解，优于HV2和NC4；FV1降解持续时间长于FC1；在65K-FKBPF36V敲入小鼠中，FV1诱导多数组织65K降解，长期65K耗竭导致小鼠出现腹部水肿、脾重降低和存活期缩短。
- 研究意义
- 该资源可帮助研究人员为其应用选择合适的降解剂和标签，并可在药物开发早期评估靶蛋白对靶向蛋白降解的易感性和在靶毒性，从而为是否将某蛋白推进至药物开发阶段提供参考。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
dTAG、HaloPROTAC和NanoTAC的剂量与时间摸索
确定能在多数降解剂中检测到降解的处理浓度和持续时间
对报告基因小鼠单次腹腔注射10、20或30 mg/kg的FC1、FV1、HV2或NC4，在0、4、8 h后取WBC，流式检测报告蛋白水平
20种组织器官中的降解谱比较
比较三种标签降解剂在全身各组织中的降解效率和广度
报告基因小鼠腹腔注射30 mg/kg降解剂8 h或24 h后，取20种组织器官，用NanoLuc发光 assay和Western blot检测报告蛋白残留水平
dTAG降解持久性评估
比较FC1和FV1单次给药后在组织中的降解持续时间
报告基因小鼠单次腹腔注射30 mg/kg FC1、FV1或溶剂对照，在24、48、72、96 h取组织，NanoLuc发光检测报告蛋白水平
免疫细胞群中的降解差异分析
比较dTAGs在不同免疫细胞类型中的降解效果，并分析E3连接酶表达与降解的关系
报告基因小鼠30 mg/kg dTAGs处理24 h后，取血、脾、骨髓制备单细胞悬液，用抗体标记Ter119、Gr1、Mac1、B220、CD4、CD8a，流式分析GFP水平；利用ImmGen RNA-seq数据制作Vhl和Cereblon表达热图
65K-FKBPF36V敲入小鼠的构建及体外验证
验证dTAG系统能否降解天然靶蛋白65K，并评估其作为降解靶点的可行性
将65K-Flag-FKBPF36V（含或不含GS linker）构建体导入小鼠真皮成纤维细胞（MDF），用FV1或FC1处理5 h，Western blot检测65K水平；利用CRISPR/Cas9将FKBPF36V标签插入Rnpc3基因C端，构建65K-Flag-FKBPF36V敲入小鼠
65K在体内的降解动力学和剂量优化
评估65K-FKBPF36V在小鼠体内的降解效果、剂量反应和持续时间
65K-FKBPF36V小鼠腹腔注射FV1或FC1，8 h后取组织Western blot检测65K；FV1剂量滴定5、10、20、35 mg/kg处理24 h；单次35 mg/kg FV1后8、16、24、32、40、48 h检测65K水平
长期65K耗竭的耐受性和安全性评估
评估长期65K降解是否可安全持续，并确定耐受剂量
65K-FKBPF36V小鼠接受FV1 20 mg/kg每日、10/5/2 mg/kg每日或2 mg/kg隔日处理，最长2周，监测存活、脾重和尸检异常
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因分型 | DirectPCR裂解试剂 | Vivagen Biotech | 102-T |
| 蛋白酶K | Sigma-Aldrich | P4850 | |
| GoTaq Green预混液 | Promega | M712 | |
| SYBR safe核酸染料 | Invitrogen | S33102 | |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Sigma | -- | |
| 青霉素 | Gibco | -- | |
| 链霉素 | Gibco | -- | |
| 质粒构建 | InFusion克隆试剂盒 | Takara Bio | -- |
| 稳定细胞系筛选 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 腹腔注射给药 | NMP的PEG400溶液 | -- | -- |
| Kolliphor HS 15 | Merck | 42966 | |
| 血常规分析 | Advia 2120i血液分析系统 | Bayer HealthCare | -- |
| 流式分析 | CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 免疫细胞群流式分析 | FACSymphony A3流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- |
| Ter119（Ly-76）抗体 | BD Biosciences | -- | |
| Gr1（Ly6G和Ly6C）抗体 | BD Biosciences | -- | |
| Mac1（CD11b）抗体 | BD Biosciences | -- | |
| CD45R/B220（RA3-6B2）抗体 | BD Biosciences | -- | |
| CD4（GK1.5）抗体 | BD Biosciences | -- | |
| CD8a（53.6.7）抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 组织蛋白提取 | 不锈钢珠 | QIAGEN | 69989 |
| TissueLyser II组织研磨仪 | QIAGEN | -- | |
| 蛋白定量 | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 |
| SDS-PAGE样品制备 | NuPAGE LDS上样缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SDS-PAGE | 4-12% Bis-Tris梯度胶 | Invitrogen | -- |
| Western blot | Immobilon-E聚偏二氟乙烯膜 | Merck | IEVH85R |
| 丽春红染色液 | Thermo Scientific | A40000279 | |
| HaloTag抗体 | Promega | G9211 | |
| FKBP12抗体 | Invitrogen | PA1-026A | |
| RNPC3/65K抗体 | Santa Cruz | sc-514951 | |
| V5标签抗体 | Thermo Fisher | 46-0705 | |
| β-Actin-HRP抗体 | Santa Cruz | sc-47778 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signalling Technologies | 2118 | |
| 过氧化物酶偶联AffiniPure山羊抗小鼠IgG H+L二抗 | Jackson ImmunoResearch Labs | 115-035-003 | |
| 过氧化物酶偶联AffiniPure山羊抗兔IgG H+L二抗 | Jackson ImmunoResearch Labs | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | 17050661 | |
| NanoLuc检测 | Nano-GLO试剂 | Promega | N1110 |
| 384孔白色壁板 | Corning | 3765 | |
| CLARIOstar plus酶标仪 | BMG Labtech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体内降解剂处理 | 降解剂剂量（2、5、10、20、30、35 mg/kg）、给药方式（腹腔或静脉注射）、溶剂（5% NMP in PEG400或20% Kolliphor HS 15）、处理时间点、小鼠年龄（至少6周） 阅读提示：Methods中"In vivo degrader treatment"小节 |
| 组织器官降解谱检测 | 组织面板（20种）、每组织生物学重复数（n=3）、检测方法（NanoLuc发光或Western blot）、30 mg/kg剂量和8 h/24 h时间点 阅读提示：Fig. 2图注及Methods中"NanoLuc assays"和"SDS-PAGE and immunoblotting"小节 |
| 免疫细胞群流式分析 | 细胞来源（血、脾、骨髓）、抗体克隆号和稀释比、GFP门控策略（GFP-、GFP+、GFP++）、处理条件（30 mg/kg dTAGs 24 h） 阅读提示：Methods中"Flow cytometry analysis of immune cell populations"小节及Supplementary Fig. 5b |
| 65K-FKBPF36V小鼠长期安全性评估 | FV1剂量（20、10、5、2 mg/kg）、给药频率（每日或隔日）、持续时间（最长2周）、每组样本量（n=4）、终点指标（存活、脾重、尸检） 阅读提示：Fig. 5图注及Results中相关段落 |
| 药代动力学分析 | HV2和NC4的剂量（2或10 mg/kg）、给药途径（腹腔或静脉注射）、小鼠品系（雄性C57BL/6）、检测机构 阅读提示：Methods中"Pharmacokinetic studies"小节及Supplementary Fig. 3 |