单核细胞激活与剪接相关基因表达分析
确定LPS激活是否改变剪接相关基因表达并验证其功能相关性。
从健康供体外周血分离CD14+单核细胞，LPS刺激3 h后进行短读长RNA-seq，分析差异表达基因和剪接相关通路；用剪接抑制剂处理并检测TNF-α表达。
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人单核细胞的天然长读长RNA测序揭示激活诱导的可变剪接转向功能性异构体
Native long-read RNA sequencing of human monocytes reveals activation-induced alternative splicing toward functional isoforms.
实验完整度
高原代单核细胞体外LPS激活、天然长读长RNA-seq、短读长验证、Ribo-seq和蛋白质组数据整合，含功能验证。
主要模型
原代人CD14+单核细胞（8名健康供体） THP-1单核细胞系（用于Ribo-seq翻译分析） 公共PBMC数据集（GSE87290体内LPS挑战） 公共单核细胞蛋白质组数据集（PXD004352）
重点核对
LPS刺激浓度100 ng/mL、时间3 h 原代单核细胞供体数及0 h与3 h配对设计 剪接抑制剂CLK-IN-T3、SRPIN340、LB-100的浓度及1 h预孵育 长读长测序中仅保留至少3条全长支持reads的异构体及TSS距CAGE峰100 bp内的标准 异构体转换验证使用的短读长数据集（本数据集和GSE103501）及qPCR/电泳验证
摘要
可变剪接是扩展转录组和蛋白质组复杂性的关键机制，但其在先天免疫激活中的作用仍不完全清楚。本研究应用Oxford Nanopore天然RNA测序，在脂多糖激活前后构建了原代人单核细胞的异构体水平转录组。我们鉴定了超过24,000个表达的异构体，包括数千个先前未注释的变体。激活诱导了广泛的异构体特异性表达变化，导致大量异构体转换事件，这些事件通过匹配的短读长RNA-Seq进行了验证。这些激活诱导的转变增强了转录本的免疫调节功能：活化的单核细胞优先表达更长、具有完整开放阅读框的编码 competent 异构体，保留内含子更少，结构域复杂性增加。通过整合匹配的Ribo-seq和蛋白质组数据，我们证明这些异构体调节与免疫效应蛋白翻译增强相关。总之，我们的发现将可变剪接定位为单核细胞激活的动态功能调节因子，强调需要异构体水平的分辨率才能充分理解免疫细胞功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 单核细胞激活是否在基因表达变化之外，通过可变剪接和异构体转换重塑转录组并影响免疫功能？
- 核心机制
- LPS激活诱导广泛的异构体转换，使单核细胞优先使用更长、编码 competent、含完整ORF且保留内含子更少的异构体，从而增强免疫效应蛋白的翻译。
- 主要证据
- 原代单核细胞天然长读长RNA-seq鉴定24,939个异构体（62%为新），检测到7,100个差异表达异构体和686个异构体转换事件；短读长RNA-seq验证转换模式；Ribo-seq和蛋白质组数据表明功能性异构体使用增加与翻译及蛋白丰度升高相关。
- 研究意义
- 将可变剪接确立为单核细胞激活的动态功能调节层，强调异构体水平分辨率对理解免疫细胞功能的重要性，并可能为免疫相关疾病机制和剪接靶向策略提供线索。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
天然长读长RNA测序鉴定新异构体
在异构体水平全面解析单核细胞表达谱并评估新异构体。
对0 h和LPS 3 h的原代单核细胞进行Oxford Nanopore天然RNA测序，使用FLAIR流程鉴定已知和新异构体，并与GENCODE、TRAILS、FLIBase比较。
激活诱导的异构体转换及剪接事件分析
确定LPS激活如何改变异构体使用和特定剪接事件。
使用IsoformSwitchAnalyzeR/DEXSeq鉴定差异异构体转换，SUPPA分析差异剪接事件，并用短读长RNA-seq数据集验证转换模式。
异构体功能特征与翻译/蛋白关联分析
评估激活后异构体转换对编码能力、翻译和蛋白丰度的影响。
分析最长ORF、productive异构体使用比例，整合THP-1 Ribo-seq数据、原代单核细胞质谱数据及公共蛋白质组数据（PXD004352），并用ESM1b计算拟然分。
NLRP3和TDP2案例验证
验证长读长测序检测到的异构体转换并确认其功能相关性。
对NLRP3和TDP2的异构体转换进行qPCR、PCR产物电泳和Western blot验证，并在剪接抑制剂处理下检测逆转。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Ficoll-paque plus | Cytiva | -- |
| 细胞分选 | 人CD14+单核细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher | -- |
| 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 剪接抑制剂处理 | CLK-IN-T3 | MedChemExpress | -- |
| SRPIN340 | MedChemExpress | -- | |
| LB-100 | MedChemExpress | -- | |
| 流式细胞术 | 可固定活性染料eFluor506 | Invitrogen | 65-0866-14 |
| CD14-PerCP-Cy5.5抗体 | Biolegend | 325622 | |
| 小鼠抗人TNF-APC抗体 | Biolegend | 502912 | |
| BD Cytofix/Cytoperm固定/透化试剂盒 | BD | 51-2090 KZ | |
| RNA提取 | RNeasy试剂盒 | Qiagen | -- |
| cDNA合成 | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| qPCR | SYBR Select预混液 | Thermo Fisher | -- |
| PCR | Phusion HF DNA聚合酶 | Fisher Scientific | 10024537 |
| 凝胶电泳 | SYBR Safe DNA凝胶染料 | Invitrogen | S33102 |
| Western blot | TTRAP多克隆抗体 | Proteintech | 12203-1-AP |
| NLRP3单克隆抗体 | adipogen | AG-20B-0014-C100 | |
| GAPDH单克隆抗体（GA1R） | ThermoFisher Scientific | MA5-15738 | |
| α-微管蛋白单克隆抗体 | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| 多克隆猪抗兔免疫球蛋白/HRP | DAKO | P0217 | |
| 多克隆猪抗兔免疫球蛋白/HRP | DAKO | P0260 | |
| RNA提取 | TRIzol LS试剂 | Thermo Fisher | -- |
| mRNA纯化 | Dynabead mRNA纯化试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| 短读长RNA-seq建库 | Rapid Directional RNA-seq试剂盒 | NEXTflex | -- |
| 短读长RNA-seq测序 | Nextseq500平台 | Illumina | -- |
| 长读长RNA-seq测序 | MinION流动池FLO-MIN106 | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN106 |
| 质谱 | Orbitrap Eclipse三合一质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单核细胞激活与剪接相关基因表达分析 | LPS浓度100 ng/mL、刺激时间3 h、供体数8、抑制剂浓度及预孵育时间1 h 阅读提示：Methods Cell culture；Fig. 1h–k图注 |
| 天然长读长RNA测序 | 每样本1 µM mRNA上样、MinION FLO-MIN106运行约2 h、至少3条全长支持reads、TSS距CAGE峰100 bp内 阅读提示：Methods Oxford Nanopore long-read RNA pipeline；Supplementary Fig. 10 |
| 异构体转换分析 | DEXSeq q-value < 0.05且|dIF| > 0.1；短读长验证数据集GSE103501 阅读提示：Methods Differential gene and isoform expression, and switching analysis；Fig. 3f |
| 翻译和蛋白关联分析 | THP-1 Ribo-seq GSE208041每条件5个Ribo-seq和4个RNA-seq重复；原代单核细胞质谱n=1/条件；PXD004352 n=3/4 阅读提示：Methods Ribo-Seq and matching RNA-Seq data—GSE208041；Mass spectrometry data；Fig. 4e–f |
| NLRP3和TDP2案例验证 | qPCR样本数（内含子保留n=9、外显子5 n=4、外显子7 n=4、延伸3'端n=9）、电泳n=3生物学重复、Western blot抗体信息 阅读提示：Methods Western blot；(q)PCR；Fig. 5g–h；Supplementary Fig. 9b |