Olomorasib生化结合与结构表征
验证olomorasib与KRASG12C的结合模式、动力学参数及选择性
解析olomorasib-KRASG12C共晶结构（1.14 Å）；测定水解速率khy=2.2 h-1、交换速率kex=6.2 h-1、kinact/KI=522,000 M-1sec-1；使用同位素标记硫醇探针进行蛋白质组半胱氨酸竞争分析；SPR测定结合亲和力
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KRASG12C抑制剂olomorasib单药及联合治疗在KRASG12C突变模型中的活性特征
Characterization of KRASG12C inhibitor olomorasib single-agent and combination with activity in KRASG12C-mutant models.
实验完整度
高包含生化结合动力学、共晶结构、细胞系、MEF、Ba/F3、异种移植、PDX及颅内模型，并有功能与机制验证
主要模型
KRASG12C突变癌细胞系（H358、SW1463、MIA-PaCa-2、H1373等） RASless MEF细胞及Ba/F3细胞 KRASG12C突变异种移植瘤模型 NSCLC PDX模型（EL3187）及颅内H358-Luc模型
重点核对
Olomorasib单药体内给药剂量10 mg/kg或30 mg/kg，每日两次（BID），持续28天 异种移植瘤接种细胞数5×10^6，肿瘤体积达200–300 mm3后随机分组，每组n=5–6只小鼠 颅内模型注射2.5×10^5 H358-Luc细胞，15天后随机分组，每组n=9只，30 mg/kg BID给药28天 PDX模型EL3187第4代肿瘤碎片10–15 mm3皮下植入，肿瘤达200–300 mm3后随机分组 体外细胞增殖检测接种2000细胞/孔，化合物最高浓度10 µM，1:3系列稀释共10个浓度点，DMSO终浓度0.4%
摘要
第一代共价KRASG12C抑制剂的疗效因耐药产生、耐受性及与免疫治疗联合的挑战而受限。我们设计了olomorasib，一种下一代GDP结合型KRASG12C抑制剂，具有纳摩尔级效力及对野生型抑制的选择性。在KRASG12C突变癌症的体外和体内模型中，olomorasib降低RAS活性和pERK水平，导致显著且大幅的肿瘤生长抑制。此外，olomorasib与免疫检查点抑制剂联合显示出比单药更强的抗肿瘤活性。进一步，我们证明即使存在临床相关的第二站点突变（已知的耐药机制及当前获批KRASG12C抑制剂的局限性），olomorasib仍能紧密结合KRASG12C。这些发现提示olomorasib可能对KRASG12C突变癌症患者作为单药或与免疫治疗联合有效。Olomorasib单药及联合治疗目前正在临床研究中。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Olomorasib作为下一代KRASG12C抑制剂，其单药及联合治疗在KRASG12C突变癌症模型中的活性如何，以及能否克服临床相关的第二站点突变耐药？
- 核心机制
- Olomorasib共价结合KRASG12C的GDP结合态，将SW-I/SW-II锁定于非活性构象，阻断与CRAF相互作用，抑制RAS活性及下游pERK信号；其不与H95或Y96直接相互作用，因此在H95D/Q/R和Y96C/D第二站点突变下仍保持紧密结合。
- 主要证据
- 生化结合动力学（kinact/KI=522,000 M-1sec-1）、共晶结构、蛋白酶组半胱氨酸选择性分析、pERK和RAS活性检测、细胞系增殖Panel、Ba/F3和RASless MEF突变体模型、异种移植和PDX模型体内疗效，以及SPR结合实验显示olomorasib在第二站点突变下的Rmax保持较高而adagrasib显著降低。
- 研究意义
- 研究提示olomorasib可能对KRASG12C突变癌症患者作为单药或与免疫治疗联合有效，并可能克服第二站点突变介导的耐药；olomorasib单药及联合治疗目前正在临床研究中。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Olomorasib体外细胞活性与选择性验证
评估olomorasib对KRASG12C突变细胞的增殖抑制、RAS活性和pERK抑制的选择性
在KRASG12C突变、非G12C突变及野生型KRAS细胞系中测定增殖IC50、RAS活性抑制和pERK抑制；在RASless MEF细胞中表达野生型及突变型RAS检测pERK；Western blot检测RAS通路蛋白
Olomorasib体外联合治疗协同性筛选
系统筛选olomorasib与潜在治疗伙伴的联合协同活性
在KRASG12C突变细胞系中将olomorasib与EGFR抑制剂erlotinib、SHP2抑制剂RMC4550、CDK4/6抑制剂abemaciclib、ERK1/2抑制剂LY3214996、PI3K抑制剂alpelisib、AurA抑制剂LY3295668和MEK抑制剂trametinib联合，计算CI50
Olomorasib单药体内疗效评估
验证olomorasib在KRASG12C突变异种移植、PDX和颅内模型中的抗肿瘤活性及对RAS/pERK的抑制
在NSCLC（H358、H1373）、胰腺（MIA-PaCa-2）、结直肠（SW1463）异种移植模型、NSCLC PDX模型及颅内H358-Luc模型中给药，检测肿瘤体积、体重、RAS活性和pERK水平及总生存
Olomorasib联合治疗体内疗效评估
验证olomorasib与abemaciclib、alpelisib、RMC4550、AurA抑制剂、cetuximab、ERK抑制剂及PD-1/PD-L1抑制剂联合的体内增强疗效
在KRASG12C突变肺癌或结直肠癌异种移植或同源模型中，肿瘤形成后按指定剂量给予olomorasib和联合药物，测量肿瘤体积和体重；在CT26 KRASG12C同源模型中联合抗PD-L1或抗PD-1抗体
Olomorasib在第二站点突变模型中的结合与活性验证
验证olomorasib在H95D/Q/R和Y96C/D第二站点突变存在下是否保持结合和抑制活性
SPR测定olomorasib和adagrasib对野生型KRAS、KRASG12C及第二站点突变KRAS的Rmax；Ba/F3细胞转染KRASG12C及第二站点突变后检测细胞活力和pERK；RASless MEF细胞转染突变体检测pERK；NCI-H1373 CRISPR knock-in第二站点突变模型检测增殖、RAS活性和pERK及体内疗效
KRASG12C抑制剂耐药机制及克服策略研究
研究olomorasib类似物耐药后的分子变化及可克服耐药的联合策略
用olomorasib类似物LY3499446处理H358和MiaPaca-2细胞直至耐药；Western blot检测耐药细胞中active KRAS、pSHP2、pEGFR、pERK等；在耐药和敏感细胞中进行化合物筛选及与olomorasib联合的CI50检测
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子结合与结构特征
验证蛋白表达与信号通路变化
验证细胞增殖与联合效应
验证靶点占据与蛋白质组选择性
评估体内抗肿瘤效果
构建突变与耐药模型
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 96孔细胞培养板 | Corning | 3603 |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo试剂 | Promega | G75723 |
| 蛋白质组半胱氨酸谱分析 | BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | 23225 |
| 测序级修饰胰蛋白酶 | Promega | V5111 | |
| 链霉亲和素 tips | Agilent Technologies | G5496-60010 | |
| 靶点占据检测 | Zeba离心脱盐板 | Thermo Scientific | 89807 |
| 胰蛋白酶/Lys-C混合物 | Promega | V5071 | |
| 同位素标记内标肽 | CPC Scientific | ID925863 | |
| pERK检测 | AlphaLISA SureFire Ultra试剂盒 | Perkin Elmer | MPSU-PTERK-K500 |
| 活性RAS检测 | Ras GTPase化学发光ELISA试剂盒 | Active Motif | 52097 |
| Western blot | 冷裂解缓冲液 | Cell Signaling Technology | 9803 |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Thermo Fisher | 1861281 | |
| DC蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | 5000112 | |
| Tris-glycine凝胶 | Invitrogen | XP04205BOX | |
| Trans-Blot Turbo转膜系统 | Bio-Rad | 1704159 | |
| 脱脂奶粉 | Bio-Rad | 1706404XTU | |
| TBS-T缓冲液 | Teknova | T9515 | |
| 牛血清白蛋白 | Fisher | BP9706100 | |
| HRP标记抗兔IgG二抗 | CST | 7074 | |
| HRP标记抗鼠IgG二抗 | CST | 7076 | |
| SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物 | Pierce | 34577 | |
| SuperSignal West Femto底物 | Thermo Scientific | -- | |
| Ba/F3细胞转染 | Neon转染系统 | Invitrogen | -- |
| Ba/F3细胞培养 | 重组小鼠IL-3 | R&D Systems | -- |
| Ba/F3细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Gibco | -- |
| Ba/F3 Western blot | HALT蛋白酶/磷酸酶抑制剂 | Thermo Fisher | -- |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| 4–20% Criterion Tris-HCl凝胶 | Bio-Rad | -- | |
| HRP标记二抗 | Amersham ECL | -- | |
| 异种移植模型 | 基质胶 | Corning | 354234 |
| 颅内模型 | D-荧光素 | -- | -- |
| SPR | 链霉亲和素传感器芯片 | Cytiva | BR100531 |
| HBS-P+缓冲液 | Cytiva | BR100671 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外细胞增殖与联合处理 | 细胞接种密度2000细胞/孔；化合物最高浓度10 µM，1:3系列稀释10个浓度点；DMSO终浓度0.4%；联合IC50根据各化合物总浓度调整；CI50<0.5为协同 阅读提示：Methods 'In vitro cell proliferation and combination treatment'小节及Fig. 2图注 |
| 体内单药疗效异种移植模型 | 细胞接种5×10^6（HBSS:Matrigel 1:1）；肿瘤体积200–300 mm3后随机分组，n=5–6只/组；olomorasib 10或30 mg/kg BID口服灌胃28天；统计时间点H358/SW837第28天、H1373第24天 阅读提示：Methods 'Xenograft models'小节及Fig. 3图注、Supplementary Table 3 |
| PDX模型 | EL3187第4代肿瘤碎片10–15 mm3皮下植入；肿瘤约200–300 mm3随机分组；n=5只小鼠；口服灌胃28天 阅读提示：Methods 'EL3187 PDX model'小节及Fig. 3E图注 |
| 颅内模型 | 2.5×10^5 H358-Luc细胞注射入纹状体3 mm；15天后随机分组n=9只/组；30 mg/kg BID给药28天；D-luciferin 150 mg/kg腹腔注射后15分钟成像 阅读提示：Methods 'Brain orthotopic model'小节及Fig. 3F图注 |
| 联合治疗体内模型 | RMC-4550联合组n=4；abemaciclib和cetuximab联合组n=5–6；PD-L1/PD-1联合组n=10；Bliss independence判定；CT26 KRASG12C同源模型抗PD-L1/PD-1完全缓解动物数分别为4/9和6/10 阅读提示：Fig. 4图注、Supplementary Fig. 4及Supplementary Tables 4和5 |
| 第二站点突变模型 | Ba/F3电穿孔参数1600 V、10 ms、3脉冲、10 µg质粒；olomorasib或adagrasib处理96 h；NCI-H1373 CRISPR knock-in第二站点突变体内模型n=6–8（H）、6（I）、5（J、K）只小鼠 阅读提示：Methods 'Ba/F3: transfection...'和'CRISPR gene editing...'小节及Fig. 5图注 |