患者样本中CSCs分选及转录组分析
鉴定晚期皮肤SCC患者CSCs的分子特征
从晚期皮肤SCC患者样本和癌旁正常皮肤FACS分选CD133+ CSCs和CD133-非CSCs，进行RNA测序，并用RT-qPCR和Western blot验证。
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组蛋白甲基化定义c-Jun/Sox2/Hif1α轴，该轴调控鳞状细胞癌的干性和肿瘤进展
Histone methylation defines c-Jun/Sox2/Hif1α axis that controls stemness and tumor progression in squamous cell carcinoma.
实验完整度
高包含患者样本、细胞系、小鼠模型和组学数据多个证据层级，并有功能与机制验证。
主要模型
晚期皮肤SCC患者样本及癌旁正常皮肤 晚期口腔SCC患者样本及癌旁正常口腔黏膜 皮肤SCC细胞系A3886和ACSCC1 口腔SCC细胞系ACOSC3、ACOSC4和ACOSC16 Sfrp1+/+、Sfrp1+/-和Sfrp1-/-小鼠DMBA/TPA诱导皮肤癌模型 NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型
重点核对
CSCs分选标志：皮肤SCC患者和细胞系使用CD133，小鼠使用Lin-/EpCAM+/CD34+/α6-integrin+，口腔SCC细胞系使用CD44+/ALDHbright DMBA/TPA诱导模型：DMBA 195 nmol/只于PD23、PD25、PD27给药，TPA 4 nmol/只每周两次 DAC处理：体外4.2 μM处理72 h；体内0.8 mg/kg体重腹腔注射每周两次 RAC1i/NSC23766处理：0.5 mg/kg体重腹腔注射 体内成瘤实验：皮肤和口腔SCC细胞系每只注射1×10^6细胞，CSCs每只注射20,000个，与Matrigel按3:1混合后皮下注射
摘要
鳞状细胞癌（SCCs）起源于不同部位，由于癌症干细胞（CSCs）的存在导致治疗耐药，生存率低。然而，皮肤和口腔SCC中调控CSCs维持的分子机制之间的交互作用尚不清楚。在这里，我们显示来自皮肤SCC患者的CSCs的全转录组谱揭示了与整体高甲基化、增强的非经典Wnt信号传导和糖酵解相关的基因表达上调，从而激活c-Jun/Sox2/Hif1α轴。因此，这表明皮肤和口腔SCC中表观遗传学/信号传导/代谢之间的交互作用。重要的是，甲基转移酶抑制剂Decitabine（DAC）和RAC1非经典Wnt抑制剂（RAC1i）的组合在皮肤和口腔SCC异种移植小鼠模型中减少了整体高甲基化和非经典Wnt信号传导，从而减弱了c-Jun/Sox2/Hif1α轴、干性和致瘤潜力。总体而言，我们的发现表明DAC和RAC1i的组合可能改善皮肤和口腔SCC患者的临床结果。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 皮肤和口腔SCC中表观遗传修饰、非经典Wnt信号和代谢重编程如何交互调控CSCs维持和肿瘤进展？
- 核心机制
- EZH2介导的组蛋白和DNA甲基化导致SFRP1启动子高甲基化和SFRP1表达缺失，激活非经典Wnt信号（WNT7B/c-JUN）；c-JUN结合SOX2启动子调控SOX2，SOX2结合HIF1α启动子调控HIF1α，进而促进HK2、LDHA等糖酵解基因表达。
- 主要证据
- 患者CSCs RNA-seq和FACS、细胞系CSCs的RNA-seq/RT-qPCR/Western blot/Seahorse、ChIP-qPCR验证EZH2-H3K27me3-SFRP1、c-JUN-SOX2和SOX2-HIF1α结合、Sfrp1-/-小鼠DMBA/TPA模型、NOD/SCID移植瘤和转移模型，以及DAC和RAC1i处理实验。
- 研究意义
- 揭示皮肤和口腔SCC中表观遗传-信号-代谢交互轴，提示DAC与RAC1i联用可能改善皮肤和口腔SCC患者临床结果。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SFRP1和非经典Wnt信号在患者样本中的表达验证
验证SFRP1缺失与非经典Wnt信号激活在皮肤和口腔SCC中的相关性
对皮肤和口腔SCC患者样本及癌旁正常组织进行IHC检测SFRP1、WNT7B、c-JUN和EZH2，并进行H-score评分和生存分析。
细胞系CSCs分离及干性、信号和代谢表型验证
在细胞系中验证CSCs的干性、非经典Wnt信号和糖酵解特征
从皮肤SCC细胞系A3886和ACSCC1中FACS分选CD133+ CSCs，进行成球实验、系列移植实验、RNA-seq、Western blot、Seahorse糖酵解速率测定和LDH活性检测。
Sfrp1敲除小鼠模型验证非经典Wnt信号和杂交EMT
在体内验证Sfrp1缺失对非经典Wnt信号和EMT的影响
使用DMBA/TPA诱导Sfrp1+/+、Sfrp1+/-和Sfrp1-/-小鼠皮肤肿瘤，分离CSCs，进行IFA、RT-qPCR和Western blot检测K14、VIMENTIN及非经典Wnt信号分子。
Sfrp1过表达对肿瘤igenic和转移潜能的影響
验证Sfrp1过表达是否逆转CSCs的致瘤和转移能力
在A3886和口腔SCC细胞系中过表达Sfrp1，进行克隆形成、BrdU、细胞周期、NOD/SCID皮下成瘤、尾静脉注射肺转移和PET/CT分析。
EZH2介导的SFRP1启动子高甲基化机制验证
验证EZH2通过H3K27me3和DNA甲基化调控SFRP1表达
在皮肤和口腔SCC细胞系中进行ChIP-qPCR检测EZH2、H3K27me3、H3K27ac和5-mc在SFRP1启动子的富集，Western blot检测EZH2、H3K27me3和H3K27ac水平。
c-JUN/SOX2/HIF1α轴及糖酵解调控验证
验证c-JUN调控SOX2、SOX2调控HIF1α、HIF1α调控糖酵解基因的机制链路
ChIP-qPCR检测c-JUN在SOX2启动子、SOX2在HIF1α启动子、HIF1α在HK2/LDHA/SLC2A2启动子的结合，以及DAC处理后结合变化；检测糖酵解基因表达、LDH活性和代谢物水平。
DAC和RAC1i体内联合治疗验证
评估DAC和RAC1i单用及联用对皮肤和口腔SCC移植瘤生长的影响
在NOD/SCID小鼠皮下接种皮肤和口腔SCC细胞，待肿瘤达150 mm3后腹腔注射DAC、RAC1i或两者联合，监测肿瘤体积。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 12800017 |
| 胎牛血清 | Hi-media | RM10409 | |
| MEM培养基 | Gibco | 61100061 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 1082147 | |
| 马血清 | Gibco | 26050088 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma | T4799 | |
| 小鼠原代细胞培养 | 胰岛素 | Sigma | IPP00 |
| 转铁蛋白 | Sigma | T2252 | |
| 氢化可的松 | Calbiochem | 386698 | |
| 霍乱毒素 | MP Biochemicals | 150005 | |
| 流式细胞术 | 抗CD45-FITC抗体 | Biolegend | 103108 |
| 抗CD31-FITC抗体 | Biolegend | 102406 | |
| 抗CD140a-FITC抗体 | eBioscience | 11-1401-82 | |
| 抗EpCAM-PE-Cy7抗体 | BioLegend | 118216 | |
| 抗小鼠CD34生物素抗体 | bioscience | 13-0341-85 | |
| 抗α6整合素-PE抗体 | BD Pharmingen | 555736 | |
| 链霉亲和素-APC | BD Pharmingen | 554067 | |
| 碘化丙啶 | Sigma | P4170 | |
| 抗人CD133-APC抗体 | BD Pharmingen | 566597 | |
| 抗人CD133-PE抗体 | BD Bioscience | 566594 | |
| Zombie Aqua可固定活性染料试剂盒 | Biolegend | 423101 | |
| AldeRed试剂 | Merck | SCR150 | |
| 药物处理 | 地西他滨 | NATCO PHARMA | 204964 |
| RAC1抑制剂NSC23766 | MedChemExpress | HY-15723A | |
| DMBA/TPA诱导 | 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯 | Sigma | P8139 |
| ChIP-qPCR | c-JUN抗体 | CST | 9165 |
| H3K27me3抗体 | CST | 9733 | |
| H3K27ac抗体 | CST | 8173 | |
| SOX2抗体 | abcam | ab92494 | |
| HIF1α抗体 | Sigma | SAB2702132 | |
| 微球菌核酸酶 | NEB | M0247S | |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 |
| ECL化学发光底物 | Cytiva | RPN2232 | |
| RT-qPCR | TRIZOL试剂 | Merck | T3934 |
| Primescript逆转录试剂盒 | Takara | RR037A | |
| TB Green预混液 | Takara | RR820A | |
| RNA提取 | PicoPure RNA提取试剂盒 | Applied Biosystems | KIT0204 |
| RNA裂解缓冲液 | Agilent Technologies | 400791-13 | |
| RNA测序 | SMARTer链特异性总RNA-seq试剂盒v3-微量输入哺乳动物 | Takara Bio | 634485 |
| 免疫荧光 | Vectashield抗淬灭封片剂 | Vector Lab | H-1000 |
| 免疫组化 | ABC试剂 | Vector lab | PK6200 |
| DPX封片剂 | Merck | 100579 | |
| 酶/底物测定 | 乳酸测定试剂盒 | Sigma | MAK570 |
| 乙酰辅酶A测定试剂盒 | Sigma | MAK039 | |
| LDH活性测定试剂盒 | Sigma | MAK066 | |
| Seahorse糖酵解速率测定 | Seahorse XF 24孔细胞培养微孔板 | Agilent | 103723-100 |
| Seahorse XF DMEM培养基 | Agilent | 103575-100 | |
| 鱼藤酮 | Sigma | R8875 | |
| 抗霉素 | Sigma | A8674 | |
| 2-脱氧葡萄糖 | Sigma | D8375 | |
| 细胞周期分析 | RNase A | Sigma | 556746 |
| 载体构建 | Tet-pLKo-puro载体 | Addgene | 21915 |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G包膜质粒 | Addgene | 12259 | |
| M50 Super 8× TOPflash报告质粒 | Addgene | 12456 | |
| pCS-CG质粒 | Addgene | 12154 | |
| Sfrp1-mGFP cDNA克隆 | Origene | RC207328L4 | |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | Sigma | P8833 |
| 多西环素 | Sigma | D9891 | |
| 动物实验 | 含多西环素饲料 | Bioserv | S3888 |
| 组织保存 | 组织保存液 | Miltenyi Biotec | 130-100-008 |
| 免疫荧光 | OCT包埋剂 | Leica | 14020108926 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本收集与CSCs分选 | 患者分期、治疗状态、样本量（皮肤SCC n=28，口腔SCC n=59，正常对照n=10和n=12）、CSCs分选标志（皮肤CD133，口腔CD44/ALDH） 阅读提示：Methods 'Human sample collection'和'Isolation of CSCs from the skin SCC patient tumor and normal skin'小节，Supplementary Table 1–3 |
| DMBA/TPA诱导小鼠皮肤癌模型 | 小鼠基因型（Sfrp1+/+、Sfrp1+/-、Sfrp1-/-）、DMBA剂量（195 nmol/只，PD23、25、27）、TPA剂量（4 nmol/只，每周两次）、给药途径（局部涂抹） 阅读提示：Methods 'Chemical-induced DMBA/TPA carcinogenesis model'小节 |
| NOD/SCID小鼠皮下成瘤实验 | 细胞数量（1×10^6细胞或20,000 CSCs）、Matrigel比例（3:1）、注射部位（侧腹皮下）、每组小鼠数（n=3-6）、肿瘤体积测量方法和终点（20 mm直径） 阅读提示：Methods 'In vivo tumorigenesis assay'相关小节和对应Figure legends |
| DAC和RAC1i体内治疗实验 | DAC剂量（0.8 mg/kg体重，腹腔注射，每周两次）、RAC1i/NSC23766剂量（0.5 mg/kg体重，腹腔注射）、治疗起始肿瘤体积（150 mm3）、每组小鼠数（n=5） 阅读提示：Methods 'Treatment with the pharmacological drug DAC and RAC1i (NSC23766)'小节和Fig. 10 legends |
| ChIP-qPCR机制验证 | 抗体用量（c-JUN 4 μg、H3K27me3 5 μg、H3K27ac 4 μg、SOX2 4 μg、HIF1α 4 μg）、染色质用量（10-15 μg）、DAC体外处理浓度和时间（4.2 μM，72 h） 阅读提示：Methods 'ChIP-qPCR assays'小节和Supplementary Table 5 |