建立MI模型并检测Caspase-8/Gsdmd通路激活
验证MI后心肌中Caspase-8及其下游Gsdmd是否被激活。
雄性C57BL/6小鼠行LAD结扎24 h，TTC染色评估梗死面积，检测梗死边缘区Caspase-8 mRNA和蛋白（含Caspase-8-p18）、Gsdmd/Gsdmd-N蛋白及Caspase-8免疫荧光。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
DNA甲基转移酶3a缺失增强Caspase-8转录并促进心肌梗死期间心肌细胞焦亡
Loss of DNA methyltransferase 3a enhances Caspase-8 transcription and promotes cardiomyocyte pyroptosis during myocardial infarction.
实验完整度
高包含小鼠MI模型、NMVCs体外缺氧/基因操作、AAV9体内过表达、Gsdmd-CKO小鼠、Co-IP、ChIP、BSP/MSP等多层功能与机制验证
主要模型
雄性C57BL/6小鼠LAD结扎24 h心肌梗死模型 新生小鼠心室心肌细胞（NMVCs） 心肌细胞特异性Gsdmd敲除（Gsdmd-CKO）小鼠
重点核对
MI模型：雄性C57BL/6小鼠（6-8周龄，22-25 g）LAD结扎24 h，以ECG ST段抬高和局部心肌苍白确认缺血 AAV9体内过表达：6周龄小鼠尾静脉注射1×10^11 vg/只，Caspase-8于注射后4周、Dnmt3a于6周后行MI手术 Caspase-8抑制：Z-IETD-fmk 4 mg/kg与necrostatin-1 3.5 mg/kg经尾静脉注射，MI前0.5 h和1 h给药 NMVCs处理：5aza 10 μM处理24 h；缺氧条件1% O2、99% N2、37°C处理24 h；si-Dnmt3a序列GCACAACAGAGAAACCTAA，si-Caspase-8序列GCGCAGACCACAAGAACAA 检测终点：超声心动图EF/FS、TTC梗死面积、H&E、电镜超微结构、ELISA检测LDH/IL-1β/IL-18、Western blot、Co-IP、ChIP、BSP/MSP
摘要
天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-8在耶尔森菌感染期间通过介导gasdermin-D（Gsdmd）的切割和激活在启动焦亡中发挥关键作用。然而，Caspase-8在心肌梗死（MI）后焦亡中的作用及其潜在机制仍不清楚。本研究表明Caspase-8对MI后心肌细胞焦亡至关重要，并且Caspase-8/Gsdmd信号通路在雄性梗死小鼠心脏中被激活。在雄性小鼠中抑制Caspase-8可挽救MI后心脏功能下降和心肌细胞焦亡。进一步显示Dnmt3a影响Caspase-8启动子CpG岛的DNA甲基化并调控Caspase-8表达。Dnmt3a过表达通过抑制心肌细胞焦亡保护雄性小鼠心肌免受MI损伤。此外，MI中Dnmt3a的减少归因于泛素化增加。我们的研究确定了一个调控轴Dnmt3a/Caspase-8/Gsdmd，该轴通过促进心肌细胞焦亡驱动缺血性心脏损伤，并提示了心脏疾病的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Caspase-8是否参与心肌梗死后心肌细胞焦亡，以及其表达是否受DNA甲基化调控。
- 核心机制
- MI诱导Dnmt3a泛素化降解，导致Caspase-8启动子CpG岛低甲基化，促进甲基化敏感转录因子Hes1结合并增强Caspase-8转录；Caspase-8切割Gsdmd产生Gsdmd-N，驱动心肌细胞焦亡。
- 主要证据
- 雄性小鼠MI模型显示Caspase-8/Gsdmd通路激活；AAV9-Caspase-8过表达诱导焦亡和心功能障碍，Gsdmd-CKO可阻断；Z-IETD-fmk抑制Caspase-8减轻MI损伤；NMVCs中Dnmt3a过表达/敲低负调控Caspase-8及甲基化水平；Co-IP显示MI心肌Dnmt3a泛素化增加。
- 研究意义
- 确立Dnmt3a/Caspase-8/Gsdmd轴作为MI后心肌细胞焦亡的调控机制，为缺血性心脏病提供潜在的表观遗传治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Caspase-8过表达诱导心肌细胞焦亡及Gsdmd依赖性验证
验证Caspase-8过表达是否通过Gsdmd诱导心肌细胞焦亡和心功能障碍。
AAV9-CMV-GFP-Caspase-8尾静脉注射小鼠，4周后检测心功能、组织形态、超微结构、血清LDH/IL-1β/IL-18、Gsdmd-N膜定位；在Gsdmd-CKO小鼠中重复Caspase-8过表达。
药理学抑制Caspase-8及Gsdmd敲除对MI的保护作用
验证抑制Caspase-8/Gsdmd轴能否减轻MI损伤。
MI小鼠联合给予Z-IETD-fmk和necrostatin-1，评估心功能、H&E、电镜、血清LDH、Gsdmd-N/IL-1β/IL-18及Gsdmd-N膜定位；Gsdmd-CKO小鼠行LAD结扎后评估心功能和炎症因子。
Caspase-8启动子DNA甲基化及Dnmt3a调控验证
探究Caspase-8在MI后上调是否由启动子低甲基化及Dnmt3a减少所致。
BSP检测MI心脏Caspase-8 CpG岛甲基化；NMVCs给予5aza；检测MI心脏Dnmt1/3a/3b蛋白；ChIP检测Dnmt3a与Caspase-8启动子结合；NMVCs过表达或敲低Dnmt3a后检测Caspase-8 mRNA/蛋白及MSP甲基化。
Dnmt3a过表达对MI心脏的保护及对Caspase-8的抑制
验证Dnmt3a过表达是否通过抑制Caspase-8减轻MI后焦亡。
AAV9-Dnmt3a尾静脉注射小鼠，6周后行LAD结扎24 h，检测心功能、H&E、电镜、血清LDH/IL-1β/IL-18、Caspase-8 mRNA/蛋白、Gsdmd-N/IL-1β/IL-18及Gsdmd-N膜定位。
Dnmt3a敲低经Caspase-8诱导焦亡的体外回补验证
验证Dnmt3a缺失通过Caspase-8/Gsdmd通路诱导心肌细胞焦亡。
NMVCs转染si-Dnmt3a和/或si-Caspase-8（加Nec-1 10 μM），检测Gsdmd-N蛋白、LDH释放及Hoechst33342/PI染色。
MI后Dnmt3a蛋白降解机制验证
探究MI后Dnmt3a蛋白减少是否由泛素-蛋白酶体降解增强所致。
检测MI心脏Dnmt3a mRNA；缺氧NMVCs检测Dnmt3a蛋白/mRNA；CHX追踪实验、MG132处理、Co-IP检测Dnmt3a泛素化；3-MA处理验证自噬溶酶体途径。
甲基化敏感转录因子Hes1调控Caspase-8的验证
筛选并验证Dnmt3a介导的低甲基化通过Hes1增强Caspase-8转录。
UCSC/JASPAR/甲基化敏感SELEX预测候选转录因子；ChIP验证Tfec、Mycn、Hes1、Zbtb33与Caspase-8启动子结合；NMVCs过表达Hes1并联合Dnmt3a过表达或敲低，检测Caspase-8 mRNA/蛋白。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| TTC染色 | 2,3,5-氯化三苯基四氮唑 | Solarbio | G3005 |
| 细胞培养 | II型胶原酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞处理 | 5-氮杂胞苷 | -- | -- |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | -- | -- | |
| 坏死他汀-1 | -- | -- | |
| Z-IETD-fmk | -- | -- | |
| MG132 | -- | -- | |
| 3-甲基腺嘌呤 | -- | -- | |
| ELISA | 乳酸脱氢酶ELISA试剂盒 | Bio Tek | 14092214 |
| IL-1β ELISA试剂盒 | MEIMIAN | MM-0040M1 | |
| IL-18 ELISA试剂盒 | MEIMIAN | MM-0169M1 | |
| Hoechst/PI染色 | Hoechst/PI染色试剂盒 | Solarbio | CA1120 |
| Western blot | 兔抗Dnmt3a抗体 | Abcam | ab188470 |
| 兔抗Caspase-8抗体 | Cell Signaling Technology | 4790 | |
| 兔抗Cleaved Caspase-8抗体 | Cell Signaling Technology | 8592S | |
| 兔抗Gsdmd抗体 | Abcam | ab219800 | |
| 兔抗IL-1β抗体 | Proteintech | 16806-1-AP | |
| 兔抗IL-18抗体 | Proteintech | 10663-1-AP | |
| 兔抗泛素抗体 | SANTA CRUZ | sc-8017 | |
| 鼠抗β-actin抗体 | Affinity | AF7018 | |
| IRDye 800CW山羊抗鼠IgG | LI-COR | 925-32210 | |
| IRDye 800CW山羊抗兔IgG | LI-COR | 925-32211 | |
| Co-IP | Protein A/G磁珠 | Sigma | HY-K0202 |
| Dnmt3a抗体 | proteintech | 20954-1-AP | |
| DNA甲基化检测 | 基因组DNA提取试剂盒 | TIAGEN | DP304-02 |
| CpGenome Turbo亚硫酸氢盐修饰试剂盒 | Merck | S7847 | |
| 甲基化特异性PCR试剂盒 | TIAGEN | EM101 | |
| 免疫荧光 | Caspase-8抗体 | ABclonal | A0215 |
| Gsdmd-N抗体 | Abcam | ab215203 | |
| α-actinin抗体 | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| ChIP | Pierce琼脂糖ChIP试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 26156 |
| Dnmt3a抗体 | Novus | IMG-268A | |
| Hes1抗体 | Novus | NBP1-47791 | |
| Mycn抗体 | Novus | NB200-109 | |
| Tfec抗体 | Proteintech | 13547-1-AP | |
| Zbtb33抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-110588 | |
| RT-qPCR | 逆转录试剂盒 | TOYOBO | -- |
| SYBR Green PCR预混液 | TOYOBO | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MI动物模型 | 小鼠品系（雄性C57BL/6，6-8周龄，22-25 g）、LAD结扎持续时间（24 h）、缺血确认标准（ECG ST段抬高和局部心肌苍白）、麻醉剂（2% 2,2,2-三溴乙醇，0.1 mL/10 g腹腔注射） 阅读提示：Methods—Animals和Mouse experiments |
| AAV9体内过表达 | AAV9血清型（AAV9）、启动子（CMV）、注射剂量（正文Methods为1×10^11 vg/只，Results中Caspase-8部分写10×10^10 vg/mouse，存在差异）、注射途径（尾静脉）、注射后至MI手术时间（Caspase-8为4周，Dnmt3a为6周） 阅读提示：Methods—Mouse experiments；Results—Forced overexpression of Caspase-8和Dnmt3a exerts cardioprotective effects部分 |
| Caspase-8药理学抑制 | Z-IETD-fmk剂量（4 mg/kg）、necrostatin-1剂量（3.5 mg/kg）、给药途径（尾静脉）、给药时间点（MI前0.5 h和1 h） 阅读提示：Results—Targeted inhibition of Caspase-8/Gsdmd axis部分 |
| NMVCs体外实验 | NMVCs来源（新生C57BL/6小鼠1-3天）、5aza浓度（10 μM）和处理时间（12 h和24 h）、缺氧条件（1% O2、99% N2、37°C、24 h）、siRNA序列（Dnmt3a: GCACAACAGAGAAACCTAA；Caspase-8: GCGCAGACCACAAGAACAA）、Nec-1浓度（10 μM） 阅读提示：Methods—Neonatal mouse ventricular cardiomyocytes culture and treatment；Results—DNA hypomethylation和Dnmt3a suppresses cardiomyocyte pyroptosis部分 |
| Gsdmd-CKO小鼠构建 | Gsdmdflox/flox与Myh6-Cre杂交策略、对照组（Gsdmdflox/flox）、基因型鉴定方法 阅读提示：Methods—Mouse experiments；Fig. 3A |
| DNA甲基化检测 | BSP和MSP的引物序列（MSP引物已在Methods列出）、亚硫酸氢盐修饰试剂盒（CpGenome Turbo Bisulfite Modification Kit，S7847）、MSP试剂盒（EM101） 阅读提示：Methods—DNA extraction and DNA methylation-specific PCR (MSP) |
| ChIP实验 | 交联条件（1%甲醛，室温10 min）、抗体（Dnmt3a IMG-268A；Hes1 NBP1-47791；Mycn NB200-109；Tfec 13547-1-AP；Zbtb33 PA5-110588）、Caspase-8启动子qPCR引物序列 阅读提示：Methods—Chromatin immunoprecipitation (ChIP) |