比较三种JAK抑制剂在DSS结肠炎中的疗效
评估托法替尼、Upadacitinib和Filgotinib对野生型和PTPN2-ΔM小鼠结肠炎严重程度的影响。
野生型和PTPN2-ΔM小鼠给予2% DSS饮水7天，同时每日两次口服灌胃三种JAK抑制剂，监测体重、疾病活动度、内镜和组织学评分，并检测结肠组织培养上清细胞因子。
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间接抑制NLRP3-白细胞介素-1β轴有助于JAK1抑制剂在实验性结肠炎和人溃疡性结肠炎中的疗效
Indirect inhibition of the NLRP3-interleukin-1β axis contributes to the efficacy of JAK1 inhibitors in experimental colitis and human ulcerative colitis.
实验完整度
高采用DSS和T细胞转移性结肠炎小鼠模型、Casp1和Nlrp3缺陷小鼠、患者来源巨噬细胞、单细胞RNA测序及患者活检免疫组化，并进行了功能与机制验证。
主要模型
DSS诱导的野生型和PTPN2-ΔM小鼠结肠炎模型 Rag1-/-小鼠T细胞转移性结肠炎模型 Casp1缺陷和Nlrp3缺陷小鼠DSS结肠炎模型 溃疡性结肠炎患者肠道活检及外周血单核细胞来源巨噬细胞
重点核对
三种JAK抑制剂均为50 mg/kg体重，每日两次口服灌胃，于DSS或naïve T细胞注射前3天开始给药 DSS结肠炎采用2% DSS饮水7天；T细胞转移模型每只Rag1-/-小鼠注射0.25×10^6 naïve T细胞 体外炎症小体激活：LPS 50 ng/ml处理24 h，MSU 150 ng/ml 6 h，TiO2 150 ng/ml 12 h，Nigericin 200 ng/ml 6 h，Flagellin 500 ng/ml 2 h，poly(dA:dT) 1 μg/ml 2 h 体外JAK抑制剂终浓度50 μM；MCC950 1 μM；剂量反应使用1 nM至100 μM 患者活检来自16例UC患者，Upadacitinib治疗8–12周前后取乙状结肠组织，按IL-1β表达中位数分为高、低组
摘要
托法替尼是一种泛Janus激酶抑制剂，而偏好性Janus激酶1抑制剂Upadacitinib和Filgotinib已被批准用于治疗溃疡性结肠炎，但其分子作用机制仍未完全阐明。在此，我们利用葡聚糖硫酸钠诱导的和T细胞转移性结肠炎模型，并结合对溃疡性结肠炎患者的分析，发现这三种抑制剂均可改善巨噬细胞特异性缺失蛋白酪氨酸磷酸酶非受体2型（该模型以Janus激酶-信号转导与转录激活因子信号过度活跃为特征）小鼠的结肠炎。相比之下，只有Upadacitinib和Filgotinib在野生型小鼠中提供增强的保护作用，而这一效应在炎症小体信号传导被遗传性破坏后消失。纵向单细胞转录组分析和肠道活检免疫染色进一步显示，Upadacitinib在体内降低白细胞介素-1β表达，且这与临床应答相关。因此，对炎症小体活性的间接抑制有助于偏好性Janus激酶1抑制剂的疗效。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 托法替尼、Upadacitinib和Filgotinib在溃疡性结肠炎中疗效差异的分子机制是什么，JAK1偏好性抑制剂是否通过JAK/STAT以外的通路发挥作用。
- 核心机制
- Upadacitinib和Filgotinib除抑制JAK/STAT信号外，还以不直接结合NLRP3的方式间接抑制NLRP3炎症小体活化，减少IL-1β成熟和分泌；该作用不依赖经典JAK1信号，可能与NF-κB、MAPK等通路下调NLRP3和IL1B表达有关。
- 主要证据
- 在DSS和T细胞转移性结肠炎中，Upadacitinib和Filgotinib较托法替尼更有效；单细胞RNA测序显示JAK1i降低巨噬细胞Nlrp3和Il1b表达；Western blot和ELISA显示JAK1i降低活化Caspase-1、IL-1β和IL-18；在Casp1或Nlrp3缺陷小鼠中保护作用消失；人巨噬细胞中仅NLRP3激活剂诱导的IL-1β被JAK1i抑制；NanoBRET未检测到JAK1i与NLRP3直接结合；UC患者Upadacitinib治疗后IL1B表达下降且与临床应答相关。
- 研究意义
- 研究提出JAK1偏好性抑制剂通过同时抑制JAK/STAT和NLRP3-IL-1β轴发挥更优疗效，为解释其临床高效性提供依据，并提示IL-1β可能作为指导临床治疗策略的生物标志物，但该假设仍需多中心前瞻性试验验证。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
T细胞转移性结肠炎模型验证疗效
在第二种结肠炎模型中比较三种JAK抑制剂的保护作用。
Rag1-/-小鼠注射WT供体来源naïve T细胞诱导结肠炎，给予JAK抑制剂并评估疾病表现。
单细胞转录组分析结肠免疫细胞
识别不同JAK抑制剂处理后与疗效差异相关的基因和通路。
DSS结肠炎小鼠第5天处死，每组4只小鼠结肠免疫细胞混合，FACS分选CD11b+和/或CD11c+细胞与CD4+ T细胞按1:1混合，进行10x单细胞RNA测序，比较托法替尼与JAK1i的差异表达基因和通路。
检测炎症小体活化相关蛋白
验证JAK1抑制剂是否在蛋白水平抑制Caspase-1和IL-1β的活化。
取JAK抑制剂处理的DSS结肠炎小鼠结肠组织裂解物，Western blot检测活化Caspase-1和IL-1β；结肠组织块培养24 h后ELISA检测上清IL-1β和IL-18。
人单核细胞来源巨噬细胞炎症小体激活实验
评估JAK抑制剂对患者来源巨噬细胞炎症小体活化的直接影响。
从IBD患者外周血分离单核细胞，M-CSF诱导分化为巨噬细胞，LPS处理24 h后MSU晶体激活NLRP3，检测上清细胞因子和Western blot活化IL-1β/Caspase-1。
Casp1和Nlrp3缺陷小鼠验证依赖性
验证Upadacitinib和Filgotinib的保护作用是否依赖炎症小体信号。
在Casp1缺陷小鼠和Nlrp3缺陷小鼠中诱导DSS结肠炎，给予JAK抑制剂，评估体重、疾病活动度、内镜和组织学评分。
区分NLRP3与其他炎症小体受体
确定JAK1抑制剂是否特异性靶向NLRP3炎症小体。
健康志愿者单核细胞来源巨噬细胞LPS处理后，分别用MSU、TiO2、Nigericin激活NLRP3，Flagellin激活NLRC4，poly(dA:dT)激活AIM2，检测IL-1β和IL-18分泌及炎症小体受体mRNA。
NLRP3直接结合与JAK1/NLRP3敲低实验
判断JAK1抑制剂是否直接结合NLRP3，以及其作用是否依赖经典JAK1信号。
使用NLRP3 NanoBRET Target Engagement assay检测JAK抑制剂与NLRP3的结合，MCC950为阳性对照；在人巨噬细胞中用siRNA敲低JAK1或NLRP3后检测IL-1β分泌。
UC患者Upadacitinib治疗前后单细胞转录组和免疫组化
在人体中验证Upadacitinib对IL1B表达的影响及其与临床应答的关系。
对4例UC患者Upadacitinib治疗8–12周前后的乙状结肠固有层免疫细胞进行单细胞RNA测序；对16例患者治疗前后活检进行IL-1β免疫组化，并按基线IL-1β中位数分组分析Mayo评分。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| T细胞分离 | EasySep™小鼠CD4+ T细胞分离试剂盒 | Stemcell Technologies | 19852 |
| T细胞分选 | Aria III分选仪 | BD | -- |
| 小鼠内镜 | IMAGE1 STM小鼠内镜 | Karl Storz | -- |
| 细胞因子检测 | 小鼠23重细胞因子检测 | BioRad | -- |
| T细胞激活 | 抗CD3/抗CD28磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 10131D |
| 炎症小体激活 | 超纯脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 尿酸钠 | Invivogen | -- | |
| 二氧化钛 | Invivogen | -- | |
| 鞭毛蛋白 | Invivogen | -- | |
| poly(dA:dT) | Invivogen | -- | |
| 核酸转染 | DOTAP转染试剂 | -- | -- |
| NLRP3抑制 | MCC950 | Sigma-Aldrich | -- |
| NLRP3结合实验 | NLRP3 NanoBRET™靶点结合 | Promega | CS1810C523 |
| NLRP3-Nanoluc®融合构建体 | Promega | N1341 | |
| GloMax® Discover发光检测仪 | Promega | GM3000 | |
| Western blot | M-PER蛋白抽提试剂 | Thermo Fisher Scientific | 23225 |
| LDS上样缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 84788 | |
| ECL化学发光液 | Thermo Fisher Scientific | 32106 | |
| 抗人IL-1β抗体 | R&D Systems | -- | |
| 抗小鼠IL-1β抗体 | R&D/bio-Techne | -- | |
| 抗人/小鼠Caspase-1抗体 | AdipoGen | -- | |
| 抗人STAT1和STAT3抗体 | Cell Signaling Technologies | -- | |
| 抗小鼠STAT1和STAT3抗体 | Cell Signaling Technologies | -- | |
| siRNA敲低 | siJAK1 | Dharmacon | M-003145-02-0005 |
| siNLRP3 | Dharmacon | M-017367-00-0005 | |
| 单细胞RNA测序 | Chromium Next GEM Chip K | 10x Genomics | -- |
| Chromium单细胞5′v2试剂盒 | 10x Genomics | -- | |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| FACS | 可固定活性染料eFluor™ 506 | eBioscience | -- |
| 抗CD45-BV785抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗CD3-BV650抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗CD4-PE-Cy7抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗CD11b-PE抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗CD11c-PE抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗CD19-APC-Cy7抗体 | Biolegend | -- | |
| 人细胞分离 | 抗人CD45 PE-Cy7抗体 | Biolegend | -- |
| 组织消化 | DNase I | Roche | -- |
| 胶原酶 | Roche | -- | |
| 免疫组化 | 抗人IL-1β抗体 | R&D Systems | AF-201-SP |
| 抗山羊IgG VisUCyte HRP聚合物抗体 | R&D Systems | VC004 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| DSS结肠炎模型与JAK抑制剂给药 | DSS浓度2%、饮水7天；JAK抑制剂50 mg/kg体重、每日两次口服灌胃、DSS前3天开始；每组n=6；PTPN2-ΔM与WT同窝对照 阅读提示：Methods“Mice and colitis induction”及Fig. 1a、Fig. 1 legend |
| T细胞转移性结肠炎 | Rag1-/-受体；每只注射0.25×10^6 naïve T细胞；JAK抑制剂注射前3天开始、每日两次；具体给药剂量文中未在Methods中单独列出 阅读提示：Methods“Mice and colitis induction”及Supplementary Fig. 1 |
| 单细胞RNA测序样本制备 | DSS第5天取样；每组4只小鼠细胞混合；CD11b+和/或CD11c+与CD4+ T细胞1:1混合；10x Genomics Chromium Single-Cell 5′v2；质控标准200–2500 unique features、线粒体<5% 阅读提示：Methods“Preprocessing and analysis of single-cell RNA-seq”及Fig. 2 legend |
| 体外炎症小体激活与JAK抑制剂处理 | LPS 50 ng/ml 24 h；MSU 150 ng/ml 6 h；TiO2 150 ng/ml 12 h；Nigericin 200 ng/ml 6 h；Flagellin 500 ng/ml 2 h；poly(dA:dT) 1 μg/ml 2 h；JAK抑制剂50 μM；MCC950 1 μM 阅读提示：Methods“In vitro assay and inflammasome activation”及Fig. 6 legend |
| Casp1/Nlrp3缺陷小鼠验证 | Casp1缺陷与WT共居至少3周；2% DSS 7天；JAK抑制剂50 mg/kg每日两次、DSS前3天开始；Casp1实验每组n=4；Nlrp3缺陷实验细节见Supplementary Fig. 6 阅读提示：Methods“Mice and colitis induction”及Fig. 5、Supplementary Fig. 6 |
| UC患者Upadacitinib治疗前后取样 | 16例UC患者，6女10男，30–62岁；Upadacitinib治疗8–12周；乙状结肠活检；Mayo评分；按IL-1β中位数分组；部分低IL-1β组患者使用Budesonide泡沫剂或Prednisone 阅读提示：Methods“Patient samples”、Fig. 7 legend及Supplementary Table 1 |