建立线粒体自噬报告体系并验证DELE1的调控作用
检测不同线粒体应激条件下DELE1对线粒体自噬水平的影响。
在HEK293T CRISPRi细胞中稳定表达mtKeima报告，构建不同PRKN表达水平的细胞系，使用oligomycin、CCCP、antimycin A、rotenone及DFP处理，流式检测线粒体自噬，免疫印迹检测LC3和COX IV。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
整合应激反应通过维持线粒体导入效率抑制PINK1依赖性线粒体自噬
The integrated stress response suppresses PINK1-dependent mitophagy by preserving mitochondrial import efficiency.
实验完整度
高多细胞系体外模型结合多种线粒体导入报告系统、免疫印迹、流式及细胞游离导入实验，含功能与机制验证
主要模型
HEK293T细胞（CRISPRi、mtKeima报告及PRKN过表达细胞系） HeLa细胞 K562细胞 PINK1敲除及eIF2αS49/52/A等基因编辑细胞系
重点核对
HEK293T mtKeima报告细胞中PRKN过表达水平（低/中/高）及DELE1敲低对线粒体自噬的流式检测 oligomycin 1.25 ng/mL或CCCP 10 μM处理24 h诱导线粒体自噬及PINK1稳定化 HSPD1前体积累及OTC-V5前体/总蛋白比值评估线粒体前导序列蛋白导入效率 split-GFP（MTSCOX8-GFP11或MTSDiablo-GFP11）报告系统检测线粒体蛋白导入效率 细胞游离线粒体蛋白导入实验中使用MTS-DHFR-flag底物及proteinase K消化
摘要
线粒体自噬对维持线粒体健康至关重要，但其水平如何适应不同应激条件尚不清楚。本研究探究了整合应激反应（ISR）的DELE1-HRI轴在调控线粒体自噬中的作用。研究发现，ISR通过维持线粒体前导序列蛋白导入，在多种线粒体应激条件下抑制PINK1依赖性线粒体自噬，且不依赖ATF4激活。线粒体前导序列蛋白导入效率与蛋白合成速率紧密相关。缺乏ISR时，蛋白合成增加使线粒体导入机器超负荷，降低导入效率。通过mTOR或通用翻译抑制剂药物性减弱蛋白合成可缓解此损伤。在严重去极化应激下，即使ISR激活，线粒体导入仍严重受损，导致显著的PINK1积累。相反，轻度线粒体应激下，ISR存在时蛋白导入更高效，导致较低水平的线粒体自噬。缺乏ISR时，线粒体蛋白导入显著受损，导致PINK1积累达到触发线粒体自噬所需的阈值水平。这些发现揭示了ISR调控的蛋白合成、线粒体蛋白导入与线粒体自噬之间的联系，为线粒体功能障碍相关疾病提供了潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ISR的DELE1-HRI轴如何调控PINK1-PRKN依赖性线粒体自噬，尤其是在轻度线粒体应激条件下？
- 核心机制
- DELE1-HRI-eIF2α轴通过减弱整体蛋白合成，维持线粒体前导序列蛋白导入效率，从而促进PINK1导入和降解，抑制PINK1依赖性线粒体自噬；该过程不依赖ATF4。
- 主要证据
- 在HEK293T等细胞中，DELE1、OMA1、HRI敲低或eIF2α磷酸化缺陷导致oligomycin等轻度应激下线粒体蛋白导入受损、PINK1在线粒体组分积累及线粒体自噬增强，而ATF4敲除无此效应；CHX、Torin1或halofuginone处理可恢复导入并抑制自噬。
- 研究意义
- 揭示了ISR调控的蛋白合成、线粒体蛋白导入与线粒体自噬之间的联系，为线粒体功能障碍相关疾病提供了潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证PINK1在DELE1敲低诱导的线粒体自噬中的必要性及PINK1稳定化
明确DELE1缺失诱导的线粒体自噬是否依赖PINK1，并检测PINK1在线粒体组分的积累。
构建PINK1敲除细胞，比较DELE1敲低后线粒体自噬；免疫印迹检测PINK1、pS65-Ub等；亚细胞分离检测线粒体与胞质组分中PINK1。
检测DELE1缺失对线粒体前导序列蛋白导入效率的影响
验证DELE1是否在应激下维持线粒体蛋白导入。
通过HSPD1前体积累、诱导型OTC-V5前体/总比值、MTSCOX8-YFP显微镜、split-GFP报告及细胞游离导入实验检测线粒体蛋白导入效率。
确定ISR通路组分及蛋白合成速率在调控导入和自噬中的作用
明确OMA1-DELE1-HRI-eIF2α轴是否通过减弱蛋白合成而非ATF4调控线粒体导入和线粒体自噬。
敲低OMA1或HRI、构建eIF2αS49/52/A及ATF4 KO细胞，检测oligomycin下线粒体自噬和蛋白导入；使用CHX、Torin1、rapamycin、halofuginone、thapsigargin及ISRIB处理。
评估线粒体自噬水平对细胞适应性的影响
检验oligomycin处理及无葡萄糖培养条件下过度或不足的线粒体自噬对细胞生长的影响。
使用不同PRKN表达水平和DELE1敲低的细胞，在oligomycin处理或无葡萄糖培养基中培养，结晶紫染色检测细胞生长。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证线粒体自噬水平
评估线粒体膜电位
评估细胞生长与活力
基因编辑与敲低
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | 11965-092 |
| RPMI培养基 | Gibco | 22400-105 | |
| 胎牛血清 | Seradigm | 1300-500 | |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | 15140122 | |
| L-谷氨酰胺 | Life Technologies | 25030081 | |
| 药物处理 | 寡霉素 | Sigma-Aldrich | 75351 |
| 抗霉素 | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| 鱼藤酮 | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| 羰基氰3-氯苯腙 | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| 去铁酮 | Sigma-Aldrich | 379409 | |
| 巴弗洛霉素A1 | Cayman | 11038 | |
| 多西环素 | Sigma-Aldrich | 631311 | |
| Torin1 | Cayman | 10997 | |
| 雷帕霉素 | Cayman | 13346 | |
| 环氧霉素 | TargetMol Chemicals | T6830 | |
| 常山酮 | Sigma-Aldrich | 50-576-300001 | |
| 毒胡萝卜素 | Sigma-Aldrich | T9033 | |
| 线粒体分离 | 哺乳动物细胞线粒体分离试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 89874 |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Thermo Fisher Scientific | 89900 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Millopore Sigma | 04693159001 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 硝酸纤维素膜 | Thermo Fisher Scientific | 77012 | |
| 抗ATF4抗体 | ProteinTech | 28657-1-AP | |
| 抗β-actin抗体 | ProteinTech | 66009-1-Ig | |
| 抗COX IV抗体 | Invitrogen | MA5-17279 | |
| 抗V5抗体 | Thermo Fisher Scientific | R96025 | |
| 抗HSPD1抗体 | Invitrogen | MA3-012 | |
| 抗LC3抗体 | ProteinTech | 14600-1-AP | |
| 抗磷酸化eIF2α(Ser51)抗体 | Cell Signaling Technology | 3398S | |
| 抗PINK1抗体 | ProteinTech | 23274-1-AP | |
| 抗PINK1抗体 | CST | 6946S | |
| 抗磷酸化泛素抗体 | CST | 62802S | |
| 抗HRI抗体 | Proteintech | 20499-1-AP | |
| 抗VDAC抗体 | Cell Signaling Technology | 4661S | |
| 流式分析 | 四甲基罗丹明乙酯 | Invitrogen | T669 |
| 活细胞成像 | Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 |
| 细胞游离线粒体蛋白导入实验 | TNT快速偶联转录/翻译系统 | Promega | -- |
| 细胞活力检测 | 多聚-D-赖氨酸 | Gibco | A3890401 |
| 无葡萄糖DMEM | Gibco | 11966025 | |
| 结晶紫粉末 | Fisher Scientific | C581-25 | |
| RT-qPCR | Quick-RNA小量提取试剂盒 | Zymo Research | R1055 |
| Maxima H Minus第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Scientific | K1652 | |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | A25742 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 线粒体自噬流式检测 | oligomycin 1.25 ng/mL或CCCP 10 μM处理24 h；PRKN过表达水平（低/中/高）；mtKeima双激发比率门控策略 阅读提示：Methods“Drug treatment”与“Mitophagy measurement by flow cytometry”；Fig. 1a、1c–1f图注 |
| PINK1稳定化与线粒体组分分析 | oligomycin 1.25 ng/mL、CCCP 5或10 μM、antimycin A 100 nM处理24 h；线粒体与胞质分离方法 阅读提示：Fig. 2b–2d图注；Methods“Mitochondrial Isolation”与“Subcellular fractionation” |
| 线粒体蛋白导入效率检测 | doxycycline 500 ng/mL诱导；split-GFP报告构建（GFP1-10或MTS-GFP1-10-degron）；流式GFP/mCherry比值；细胞游离导入中proteinase K 10 μg/ml 阅读提示：Fig. 3d–3i图注；Methods“Mitochondria isolation and mitochondrial protein in vitro import assay” |
| 蛋白合成抑制与ISR调控实验 | CHX 0.05–20 μg/mL、Torin1 50–1000 nM、halofuginone 2.5–80 nM、ISRIB 10–2000 nM的浓度范围及与oligomycin/CCCP共处理24 h 阅读提示：Fig. 4g–4n、Fig. 5a–5d图注；Methods“Drug treatment” |
| 细胞生长与活力检测 | oligomycin 1.25 ng/mL处理24/48 h；无葡萄糖培养24/48/72/96 h；结晶紫染色及562 nm吸光度 阅读提示：Fig. 6a、6e图注；Methods“Cell viability assay” |