构建谱系可追踪Dicer1突变小鼠模型
建立可受控激活Dicer1 RNase IIIb突变并追踪细胞谱系的DRTP肉瘤模型。
将Hic1CreERT2、Dicer1fl/fl-D1693N和Rosa26LSL-tdTomato等位基因杂交获得HDT小鼠，他莫昔芬诱导后表达半合子Dicer1D1693N并永久标记tdTomato；观察肾脏肿瘤发生、组织学和基因组特征。
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空间单细胞转录组学分析揭示DICER1综合征相关肉瘤的肿瘤发育层级
Spatial single cell transcriptomic analysis informs tumor developmental hierarchy of DICER1 syndrome related sarcoma.
实验完整度
高含谱系追踪GEMM、scRNA-seq、空间转录组、原代细胞功能验证及人患者样本验证
主要模型
Hic1CreERT2/CreERT2;Dicer1fl/fl-D1693N;Rosa26LSL-tdTomato小鼠（HDT） 原代tdTomato+肾脏间充质细胞 人DICER1间充质肿瘤患者样本（16例） 正常对照小鼠肾脏
重点核对
HDT小鼠他莫昔芬诱导：3–7周龄2 mg/24 h连续5天；2周龄1 mg/24 h连续3天；P10 1 mg 肿瘤渗透率80%（52/65），中位潜伏期378天 scRNA-seq：5个HDT肿瘤；空间转录组：24个肿瘤和15个非肿瘤肾脏 人患者样本16例（4 LGMT DICER1、11 SARC DICER1、1 PIS DICER1） 靶向测序：Dicer1 D1693N、Kras和Trp53热点突变；sWGS拷贝数分析
摘要
DICER1相关肿瘤易感（DRTP），也称为DICER1综合征，主要包括发生于儿童和年轻成人的一系列恶性肿瘤。大多数为肉瘤，无论其解剖起源如何，均表现出组织学和分子相似性，并且仅表达RNase IIIb结构域缺陷的DICER1。为了揭示其细胞起源和发育层级，我们建立了一种谱系可追踪的基因工程小鼠模型，该模型可在Hic1+间充质基质细胞中受控激活半合子Dicer1 RNase IIIb突变。这导致肾脏肿瘤，在组织学和分子上紧密镜像人类DRTP肉瘤的发育连续谱。空间单细胞转录组学分析揭示了一个Hic1+Pdgfra+Dpt+Pi16+成纤维祖细胞群体，对应于肾集合管移行上皮下方的普遍成纤维细胞，其可经历横纹肌母细胞分化或成为增殖性肉瘤细胞。对患者样本的研究发现了类似的细胞状态和发育轨迹。本研究揭示了DRTP肉瘤的成纤维细胞起源，并为未来的机制和转化研究提供了忠实的 mouse model。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DICER1综合征相关肉瘤的细胞起源和发育轨迹是什么。
- 核心机制
- Dicer1 RNase IIIb突变扰动Hic1+间充质基质细胞衍生普遍成纤维细胞的分化潜能，使其经Progen细胞向肌源性分化或经拷贝数改变和p53/MAPK通路变化进展为增殖性肉瘤细胞。
- 主要证据
- 谱系可追踪HDT小鼠产生模拟人类DRTP肉瘤的肾脏肿瘤；scRNA-seq和空间转录组鉴定Progen、TR Diff Myo、Diff Myo、Ground和Prolif细胞状态及轨迹；原代细胞实验显示Dicer1突变增加普遍成纤维细胞标志物；p53敲除加速Dicer1突变细胞增殖；人患者样本空间转录组重现类似细胞状态和空间关系。
- 研究意义
- 揭示DRTP肉瘤的成纤维细胞起源，提供忠实的 mouse model 用于未来机制和转化研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
解析正常小鼠肾脏Hic1+间充质基质细胞谱系组成
建立正常肾脏Hic1+ MSC的空间组成作为肿瘤发育轨迹的参照。
对对照小鼠肾脏进行scRNA-seq和靶向空间转录组（10× Genomics Xenium，379基因），鉴定tdTomato+ MSC亚群及其空间定位。
刻画HDT小鼠Dicer1肾肉瘤的细胞状态和空间组成
鉴定肿瘤内Hic1+ MSC来源的细胞状态及其空间分布。
对5个HDT原发肾肿瘤进行scRNA-seq，并与正常肾脏数据共聚类；对24个HDT肿瘤和15个非肿瘤肾脏进行靶向空间转录组分析。
原代细胞培养与Dicer1突变功能验证
验证Dicer1突变对Hic1+ MSC衍生细胞分化标志物表达和增殖的影响。
从对照和HDT小鼠他莫昔芬处理后4周的肾脏分离tdTomato+细胞，FACS富集后培养于Mesencult或DMEM/F12+10% FBS；进行bulk RNA-seq和qRT-PCR；用CRISPR/Cas9敲除p53并检测细胞增殖。
轨迹推断和拷贝数分析
推断HDT肿瘤Hic1+ MSC谱系的发育轨迹及拷贝数改变的关系。
使用Monocle 3对HDT肿瘤Hic1+ MSC谱系进行轨迹推断和拟时序分析；使用inferCNV从scRNA-seq数据推断拷贝数变化。
人DRTP肉瘤空间转录组验证
验证小鼠Dicer1肉瘤细胞状态是否在人DRTP肉瘤中保守存在。
对16例人DRTP间充质肿瘤进行10× Genomics Xenium空间转录组分析，并与小鼠细胞状态比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证细胞功能变化
产品清单
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HDT小鼠模型诱导 | 他莫昔芬剂量和给药方案（3–7周龄2 mg/24 h连续5天；2周龄1 mg/24 h连续3天；P10 1 mg）；腹腔注射；诱导年龄 阅读提示：Methods“Model development and cohort assembly” |
| 肿瘤渗透率和潜伏期分析 | HDT小鼠65只、对照55只；终点定义（死亡或濒死处死）；渗透率以死亡时宏观或微观肿瘤为准；中位潜伏期378天 阅读提示：Methods“Model development and cohort assembly”及Fig. 1c |
| scRNA-seq和空间转录组样本 | scRNA-seq：5个HDT肿瘤、7只对照小鼠肾脏；空间转录组：24个HDT肿瘤、15个非肿瘤肾脏、9只对照小鼠；样本年龄和性别分布 阅读提示：Methods“Model development and cohort assembly”及Supplementary Data 5 |
| 原代细胞培养和CRISPR/Cas9功能实验 | 他莫昔芬处理时3周龄，4周后取材；FACS富集tdTomato+细胞；培养基（Mesencult或DMEM/F12+10% FBS）；p53 gRNA序列；n=3技术重复 阅读提示：Methods“Primary cell culture”和“Cloning, lentivirus packaging, and cell proliferation” |
| 人患者样本空间转录组 | 16例人DRTP间充质肿瘤（4 LGMT DICER1、11 SARC DICER1、1 PIS DICER1）；年龄1个月至69岁；10男6女；伦理批准S660/2020 阅读提示：Methods“Patient samples”及Fig. 5a |