构建前列腺特异性Foxa1/Pten双敲除小鼠模型
在免疫健全自体前列腺癌背景下研究FOXA1缺失的作用。
将PbCre4小鼠与Foxa1f/f及Ptenf/f小鼠杂交，生成PbCre4:Ptenf/fFoxa1f/f（PF）和PbCre4:Ptenf/f（P）小鼠，并通过基因型鉴定和IHC验证PTEN与FOXA1蛋白缺失。
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FOXA1缺失驱动前列腺癌基底/鳞状去分化并诱导免疫抑制肿瘤微环境
FOXA1 loss drives basal/squamous de-differentiation of prostate cancer and induces an immunosuppressive tumor microenvironment.
实验完整度
高含基因工程小鼠模型、scRNA-seq、空间转录组、ChIP-seq、谱系流式及体外共培养等多层级功能与机制验证
主要模型
PbCre4:Ptenf/fFoxa1f/f（PF）基因工程小鼠前列腺肿瘤 去势PbCre4:Ptenf/fFoxa1f/f（XPF）小鼠模型 PC3细胞与患者来源单核细胞衍生巨噬细胞共培养 人前列腺癌临床样本及公共数据集
重点核对
PF与P小鼠在12周、15周、18周及去势条件下的组织学与IHC分组比较 Foxa1/Pten条件性敲除的基因型鉴定及PTEN、FOXA1蛋白缺失验证 FOXA1 ChIP-seq在18周龄P与PF小鼠前列腺中的三个生物学重复 TGF-β受体I抑制剂Galunisertib 5 μM处理24 h的PC3共培养迁移实验 TGFBi 75 mg/kg每日两次、持续三周的PF肿瘤同种移植治疗
摘要
FOXA1是一种前列腺谱系决定转录因子，在前列腺癌（PCa）中频繁失调或突变。尽管已有报道FOXA1兼具促癌和抑癌功能，但其在免疫健全PCa背景下的作用仍不清楚。在此，我们表明在Pten缺陷小鼠中前列腺特异性敲除Foxa1可通过将腔面PCa细胞重编程为基底/鳞状样状态并促进免疫抑制肿瘤微环境来驱动肿瘤进展。组织学和转录组学分析显示肿瘤具有侵袭性，伴有广泛的基底/鳞状特征、反应性间质和紊乱的组织结构。机制上，FOXA1直接抑制基底/鳞状和炎症基因，这些基因在其缺失后被激活。这伴随着免疫抑制性髓系细胞积累、T细胞功能障碍和免疫抑制性细胞因子信号。总之，这些发现表明FOXA1作为腔面身份的维持者发挥抑癌作用，其缺失驱动基底/鳞状去分化、炎症反应和免疫抑制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在免疫健全的自体前列腺癌模型中，FOXA1缺失如何影响肿瘤谱系身份和肿瘤免疫微环境。
- 核心机制
- FOXA1直接结合腔面基因增强子促进其表达，同时结合基底/鳞状及炎症基因调控元件抑制其表达；其缺失导致腔面向基底/鳞状去分化，并经TGF-β等细胞因子信号驱动免疫抑制。
- 主要证据
- PbCre4:Ptenf/fFoxa1f/f小鼠显示基底/鳞状去分化、反应性间质和生存期缩短；scRNA-seq与空间转录组显示基底/鳞状细胞及免疫抑制性髓系细胞增加、T细胞功能障碍；ChIP-seq显示FOXA1结合并抑制基底/鳞状和炎症基因；共培养显示FOXA1敲低经TGF-β促进巨噬细胞迁移。
- 研究意义
- 确立FOXA1为维持前列腺上皮谱系身份并抑制侵袭性前列腺癌的抑癌因子，揭示其通过肿瘤细胞内在和外在作用调控肿瘤免疫微环境，为FOXA1低表达前列腺癌的TGF-β等通路研究提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
组织学与生存分析评估肿瘤表型
比较Foxa1缺失对前列腺肿瘤组织结构和生存的影响。
对15周龄及各时间点P与PF小鼠前列腺进行H&E和IHC染色，检测AR、KRT8、p63、Ki67，并进行Kaplan-Meier生存分析；对去势XP与XPF小鼠进行同样分析。
单细胞转录组解析谱系可塑性
明确Foxa1缺失引起的上皮细胞谱系转变。
对P12、PF12、P18、PF18、XP、XPF前列腺进行10x Genomics scRNA-seq，聚类注释细胞类型，并进行拟时序轨迹分析。
ChIP-seq验证FOXA1直接调控靶基因
确定FOXA1是否直接结合并调控腔面、基底/鳞状及炎症基因。
对18周龄P与PF小鼠前列腺进行FOXA1和H3K27ac ChIP-seq，分析结合峰、基序及邻近基因功能富集。
免疫微环境单细胞与流式验证
评估Foxa1缺失对免疫细胞组成和功能状态的影响。
对P15和PF15小鼠CD45+免疫细胞进行PIP-seq scRNA-seq，并对18–21周龄P（n=6）与PF（n=7）小鼠前列腺进行Cytek光谱流式分析。
空间转录组定位免疫细胞分布
解析肿瘤与免疫细胞的空间组织关系。
对12周和18周龄P与PF小鼠前列腺切片进行10x Genomics Visium空间转录组，并用TESLA注释细胞类型分布。
细胞通讯分析与TGF-β功能验证
明确上皮细胞向免疫细胞传递免疫抑制信号的通路。
用CellChat分析分泌信号互作，并通过PC3-WT与FOXA1敲低细胞与患者来源巨噬细胞共培养及TGFBi处理验证巨噬细胞迁移。
体内TGF-β抑制实验
评估靶向TGF-β信号对Foxa1缺陷肿瘤生长的影响。
将PF肿瘤皮下接种至NOD-SCID小鼠，给予Galunisertib或溶剂对照三周后比较肿瘤重量。
人前列腺癌数据验证
在临床样本中验证小鼠模型的谱系转变和免疫抑制发现。
分析179例原发前列腺癌数据集、208例CRPC SU2C数据集及17例人前列腺癌scRNA-seq数据，评估FOXA1与免疫标志物、谱系基因及通路的相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| H&E染色 | 伊红染色液 | VWR | 95057-848 |
| Permount封片剂 | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| IHC染色 | FOXA1抗体 | Abcam | ab170933 |
| PTEN抗体 | Cell Signaling Technology | 9188 | |
| 雄激素受体抗体 | Abcam | ab108341 | |
| p63抗体 | Santa Cruz | sc-25268 | |
| 细胞角蛋白8抗体 | Biolegend | 904804 | |
| pSMAD2抗体 | MilliporeSigma | AB3849 | |
| F4/80抗体 | CST | 70076 | |
| CD4抗体 | CST | 25229 | |
| CD8抗体 | CST | 98941 | |
| 单细胞RNA测序 | Chromium单细胞3'建库试剂盒v3.1 | 10x Genomics | -- |
| 组织解离 | 木瓜蛋白酶解离试剂盒 | Worthington-Biochem | -- |
| 流式分选 | Zombie Aqua活死细胞染料试剂盒 | Biolegend | 423101 |
| Fc受体封闭抗体 | Biolegend | 156603 | |
| APC抗小鼠CD45抗体 | Biolegend | 147707 | |
| PIP-seq单细胞测序 | PIPseq T20 3'单细胞RNA试剂盒v3.0 | -- | -- |
| ChIP-seq | FOXA1抗体 | Abcam | ab23738 |
| H3K27ac抗体 | CST | 8173S | |
| 果蝇H3抗体 | Active motif | 61686 | |
| DNA纯化浓缩试剂盒 | ZYMO Research | -- | |
| ChIP-seq建库 | NEBNext建库试剂盒 | NEB | E7645L |
| 流式分析 | 固定/透化试剂 | eBioscience | 00-5223-56 |
| 透化/洗涤缓冲液 | eBioscience | 00-8333-56 | |
| CyTEK AURORA光谱流式细胞仪 | Cytek | -- | |
| PBMC分离 | Ficoll-Paque PLUS分离液 | GE Healthcare | 45-001-750 |
| 抗CD14磁珠 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 细胞培养 | 含L-谷氨酰胺的RPMI1640培养基 | Corning Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Gibco Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Hyclone VWR | -- | |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Gibco Thermo Fisher Scientific | -- |
| 巨噬细胞分化 | 集落刺激因子1 | RnD systems | -- |
| 细胞培养基质 | I型胶原 | Advanced BioMatrix | 5005 |
| 纤连蛋白 | Sigma-Aldrich Millipore Sigma | F1141 | |
| 微流控共培养 | Stacks微流控培养板 | Protolabs | 1121-5161-007 |
| 药物处理 | Galunisertib（LY2157299） | -- | -- |
| 基质消化 | I型胶原酶 | Sigma-Aldrich Millipore Sigma | -- |
| mRNA分离 | Dynabeads mRNA直接分离试剂盒 | Invitrogen Thermo Fisher Scientific | -- |
| 逆转录 | Superscript IV VILO预混液 | Invitrogen Thermo Fisher Scientific | -- |
| RT-qPCR | TaqMan预扩增预混液 | Applied Biosystems Thermo Fisher Scientific | -- |
| TaqMan快速预混液 | Bio-Rad | -- | |
| CCL2 TaqMan基因表达检测 | Life Technologies | Hs00234140_m1 | |
| TGFB3 TaqMan基因表达检测 | Life Technologies | Hs01086000_m1 | |
| FOXA1 TaqMan基因表达检测 | Life Technologies | Hs04187555_m1 | |
| MIF TaqMan基因表达检测 | Life Technologies | Hs00236988_g1 | |
| 共聚焦显微镜 | Hoechst 33342染料 | eBioscience Thermo Fisher Scientific | -- |
| 抗CD14抗体 | BD Biosciences | 561708 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因工程小鼠模型构建 | PbCre4传递方式仅经雄性种鼠；Pten仅用杂合敲除雄鼠繁育；背景为C57BL/6；基因型鉴定引物与条带大小 阅读提示：Methods中Generating genetically engineered mouse models及Supplementary Data 4 |
| 肿瘤组织学与IHC分析 | 取材时间点（9、12、15、18周及去势后3–12个月）；抗体稀释比例；每基因型生物学重复数 阅读提示：Methods中IHC Staining、FFPE mouse tissue harvesting及Fig. 1、S1图注 |
| scRNA-seq与空间转录组 | 每条件仅分析一只小鼠前列腺肿瘤；细胞回收目标4000–5000；Visium每个时间点一对样本 阅读提示：Methods中Single cell RNA-seq、Spatial Transcriptomics及Fig. 2、5图注 |
| FOXA1 ChIP-seq | 18周龄P与PF各3个生物学重复；FOXA1 ChIP 40 mg、H3K27ac 20 mg组织；spike-in归一化 阅读提示：Methods中ChIP-seq of mouse prostate tumors及ChIP-seq data analysis |
| 体外共培养与TGFBi处理 | PC3接种150k cells/mL、巨噬细胞3×10^6 cells/mL；CSF1 50 ng/mL第1、4天；Galunisertib 5 μM处理24 h；n=6患者样本 阅读提示：Methods中Cell Culture & TGFB Receptor Inhibitor Treatment及Fig. 6H |
| 体内同种移植治疗实验 | Galunisertib 75 mg/kg每日两次、持续三周；NOD-SCID小鼠三对；肿瘤重量为终点 阅读提示：Methods中PF tumor allografts及Figure S6J |
| 人前列腺癌数据验证 | GSE21034 n=179；SU2C n=208；GSE181294 17例按FOXA1高/低分组；CIBERSORTx参数 阅读提示：Methods中CIBERSORTx analysis及Fig. 7图注 |