CBPAA敲入小鼠表型鉴定
确定CBP磷酸化受损是否引起结肠异常。
构建Ser1383/1387突变为丙氨酸的CBPAA小鼠，检测体重、结肠长度、粪便隐血与稠度、肠通透性及H&E组织学，并检测pCBP与总CBP。
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CBP磷酸化通过versican支持干细胞龛维持肠道稳态
CBP phosphorylation maintains intestinal homeostasis by supporting the stem cell niche through versican.
实验完整度
高含CBPAA敲入小鼠、骨髓嵌合体、原代结肠类器官、HCT116细胞、UC患者组织及RNA-seq，并有p53敲除、versican回补和磷酸化模拟突变的功能与机制验证。
主要模型
CBPAA及CBPAAp53ΔIEC基因敲入小鼠 小鼠结肠隐窝来源的3D结肠类器官 WT与p53−/− HCT116细胞 溃疡性结肠炎患者结肠组织
重点核对
CBPAA小鼠在Ser1383/1387位点敲入丙氨酸，以CBPWT同窝小鼠为对照 BrdU按100 mg/kg腹腔注射，于注射后2、24、48、96 h检测IEC迁移 重组小鼠versican按100 ng/mL从第0天加入CBPAA类器官，gefitinib按1 μM从第3天加入 类器官按每孔400个隐窝接种，第6天计算成球效率与直径 RNA-seq以|log2FC|>0.5且padj<0.05为差异基因阈值
摘要
CREB结合蛋白（CBP）是一种转录共激活因子，我们曾报道其磷酸化可调控细胞命运。磷酸化受损的CBP在CBPAA小鼠中改变了对p53的结合偏好，导致远端结肠异常。这些变化伴随versican表达降低，versican是一种支持肠道干细胞龛的细胞外基质成分，其减少导致肠上皮细胞（IEC）增殖及类器官形成受损。在CBPAA小鼠的IEC中敲除p53（CBPAAp53ΔIEC）可恢复versican表达并逆转结肠表型。补充versican以及磷酸化模拟CBP突变体可恢复CBPAA类器官中的versican表达和IEC干性。重要的是，溃疡性结肠炎患者的结肠组织表现出CBP磷酸化受损、CBP–p53结合增加、versican表达及IEC增殖下降，突显了这一现象的临床相关性。本工作证明CBP磷酸化通过versican维持干细胞龛从而保障肠道稳态，提示versican是炎症性肠病的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CBP磷酸化受损如何通过CBP–p53结合及细胞外基质成分影响肠上皮干细胞龛与结肠稳态。
- 核心机制
- CBP Ser1383/1387磷酸化受损增强CBP与p53结合，抑制versican表达，削弱IEC干性与隐窝更新，导致结肠异常；该过程依赖EGFR通路。
- 主要证据
- CBPAA小鼠出现结肠缩短、隐血及通透性增加和增殖下降；PLA与CUT&RUN显示CBP–p53结合及p21启动子富集增强；p53的IEC特异性缺失恢复versican、Ki-67与类器官形成；versican回补及DD/EE突变体 rescue 类器官表型。
- 研究意义
- 作者提出CBP磷酸化通过versican维护干细胞龛以保障肠道稳态，并提示versican是炎症性肠病的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
骨髓嵌合体确定细胞来源
判断结肠异常由造血还是非造血细胞驱动。
以CD45.1 WT与CD45.2 CBPAA骨髓移植入受照受体，6周后评估结肠表型、组织学、mLN细胞数及F4/80、Ly6G浸润。
IEC增殖与更新检测
评估CBP磷酸化受损对肠上皮更新的影响。
检测Ki-67阳性IEC，并用BrdU脉冲-追踪观察BrdU+细胞从隐窝向腔面的迁移。
CBP–p53结合及p21调控验证
验证突变CBP是否偏好结合p53并调控其靶基因。
用PLA检测结肠IEC中CBP–p53结合，IHC检测p21与p53，CUT&RUN检测CBP与p53在p21启动子的富集。
HCT116成球实验
在细胞水平验证CBP–p53结合对干性的影响。
用IKK抑制剂CYL-19s处理WT与p53−/− HCT116细胞，检测CBP–p53结合、p21、ALDH1A1、活力及成球。
结肠类器官表型与p53缺失 rescue
在原代上皮体系中验证干性损伤及p53依赖性。
建立隐窝来源3D类器官，比较CBPWT、CBPAA及CBPAAp53ΔIEC的pCBP、Ki-67、活力、直径与成球效率。
RNA-seq筛选versican
寻找介导干性下降的差异表达基因。
对四组小鼠结肠隐窝富集上皮细胞进行RNA-seq，并用qPCR与免疫荧光验证Vcan及E-cadherin。
versican回补与EGFR通路验证
验证versican对IEC干性的作用及EGFR通路参与。
向CBPAA类器官加入重组versican，并联合gefitinib，检测直径、成球效率、Ki-67与E-cadherin。
磷酸化模拟CBP突变体过表达
验证CBP磷酸化对versican表达及表型的直接影响。
将DD或EE突变体转染CBPAA类器官单细胞，检测versican、成球效率、直径、Ki-67与E-cadherin。
UC患者组织验证
评估CBP磷酸化–p53–versican轴在人类UC中的相关性。
检测UC患者与健康对照结肠组织中pCBP、CBP、CBP–p53 PLA、versican、Ki-67与IKKα。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 小鼠基因型鉴定 | KAPA小鼠基因分型试剂盒 | KAPA Biosystems | KK7352 |
| 药物处理 | CYL-19s | -- | -- |
| 细胞因子处理 | 重组人TNF-α | Peprotech | 300-01A |
| 重组小鼠TNF-α | Peprotech | 315-01A | |
| 类器官versican回补 | 重组小鼠versican蛋白 | Abbexa | abx069663 |
| 细胞因子处理 | 重组小鼠EGF | Peprotech | 315-09 |
| EGFR通路抑制 | 吉非替尼 | LC Laboratories | G-4408 |
| 粪便隐血检测 | Hemoccult Sensa隐血检测 | Beckman Coulter | 64151 |
| 在体与离体肠通透性检测 | FITC-葡聚糖 | Sigma-Aldrich | FD4 |
| 免疫组化检测 | TnAlink聚合物检测系统 | BioTnA | TAHC04D |
| 免疫组化抗原修复 | Tris-EDTA热诱导抗原修复液 | ScyTek | TES500 |
| 免疫组化/免疫荧光 | 抗磷酸化CBP抗体 | GeneTex | GTX90661 |
| 抗CBP抗体 | Cell Signaling Technology | 7389 | |
| 免疫组化 | 抗F4/80抗体 | Cell Signaling Technology | 70076 |
| 抗Ly6G抗体 | R&D | MAB1037 | |
| 免疫组化/免疫荧光/PLA | 抗p53抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-126 |
| 免疫组化/免疫荧光 | 抗p21抗体 | Cell Signaling Technology | 2947 |
| 抗versican抗体 | Abcam | ab19345 | |
| 免疫组化 | 抗IKKα抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7606 |
| 免疫荧光 | 抗Ki-67抗体 | Cell Signaling Technology | 9129S |
| 抗E-cadherin抗体 | Invitrogen | 33-4000 | |
| Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| Alexa Fluor 594标记山羊抗兔IgG | Invitrogen | A-11037 | |
| Alexa Fluor 594标记山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | A-11005 | |
| 免疫荧光封片 | 含DAPI的ProLong Gold抗淬灭封片剂 | Invitrogen | P36935 |
| 冰冻切片包埋 | FSC 22冰冻切片包埋介质 | Leica Biosystems | 3801480 |
| BrdU标记 | 5-溴-2′-脱氧尿苷 | Sigma-Aldrich | B5002 |
| BrdU免疫组化 | 抗BrdU抗体 | Abcam | ab6326 |
| 组织固定 | Formalde-Fresh固定液 | Fisher Scientific | SF-94 |
| CUT&RUN | CUT&RUN检测试剂盒 | Cell Signaling Technology | 86652 |
| CUT&RUN/免疫组化 | 抗CBP抗体 | Cell Signaling Technology | 7389 |
| CUT&RUN | 抗p53抗体 | Cell Signaling Technology | 2524 |
| CUT&RUN qPCR | SYBR Green | Thermo Fisher Scientific | A46109 |
| 类器官传代解离 | TrypLE解离液 | Gibco | 12563-011 |
| 类器官培养 | Y-27632 | LC Laboratories | Y-5301 |
| 类器官包埋 | Matrigel基质胶 | Corning | 356231 |
| 类器官基础培养基 | Advanced DMEM/F12培养基 | Gibco | 12634-034 |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2添加剂 | Gibco | 17502-048 | |
| B27添加剂 | Gibco | 17504-044 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| 类器官活力检测 | MTT | Sigma-Aldrich | M2128 |
| 十二烷基硫酸钠 | Invitrogen | 15525017 | |
| 类器官活细胞成像 | 8孔腔室载玻片 | Merck | PEZGS0816 |
| 8孔腔室盖玻片 | Thermo Scientific | 155411 | |
| 类器官转染 | Lipofectamine干细胞转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | STEM00001 |
| PLA | Duolink原位PLA试剂盒 | Sigma-Aldrich | DUO92101 |
| 抗p65抗体 | Cell Signaling Technology | 6956 | |
| Western blot裂解 | RIPA裂解液 | Thermo Scientific | 89901 |
| 蛋白酶与磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Scientific | 78442 | |
| Western blot蛋白定量 | Bio-Rad蛋白定量染料试剂 | Bio-Rad Laboratories | 500-0006 |
| Western blot转膜 | 硝酸纤维素膜 | Thermo Scientific | 88018 |
| Western blot显影 | T-Pro LumiDura化学发光检测试剂盒 | T-Pro Biotechnology | JT96-K006M |
| Western blot | 抗ALDH1A1抗体 | Cell Signaling Technology | 12035 |
| 抗HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 抗Lgr5抗体 | Abcam | ab75850 | |
| 抗vinculin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-25336 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 抗actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Western blot二抗 | HRP标记抗小鼠IgG | Cell Signaling Technology | 7076S |
| HRP标记抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Scientific | 15596018 |
| cDNA合成 | M-MLV逆转录5×反应缓冲液 | Promega | M531A |
| dNTP | FocusBio | BTCP-10M | |
| M-MLV逆转录酶 | Promega | M1705 | |
| RNase抑制剂 | Promega | N2518 | |
| 实时定量PCR | PowerTrack SYBR Green预混液 | Thermo Fisher Scientific | A46109 |
| 流式细胞术 | 抗CD45.1抗体 | BD Biosciences | 565212 |
| 抗CD45.2抗体 | BD Biosciences | 612778 | |
| 抗CD4抗体 | eBioscience | 12-0042-82 | |
| 抗CD8α抗体 | BioLegend | 100711 | |
| 抗TCR-β抗体 | BioLegend | 109205 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CBPAA小鼠结肠表型 | CBPAA敲入策略为Ser1383/1387替换为丙氨酸；对照为CBPWT同窝小鼠；8周龄雌性小鼠；粪便评分n=10只/组；在体通透性于灌胃FITC-dextran后4 h检测 阅读提示：Methods之Mice与Assessment of intestinal permeability in vivo；Fig. 1图注 |
| 骨髓嵌合体实验 | 受体为6 Gy×2次照射；尾静脉注射5×10^6骨髓细胞；6周后评估；WT→AA n=10、AA→WT n=7 阅读提示：Methods之Generation of bone marrow chimeras；Fig. 2图注 |
| IEC增殖与BrdU追踪 | BrdU 100 mg/kg腹腔注射；于2、24、48、96 h取样；各时间点样本量不同（如96 h：CBPWT n=8、CBPAA n=6） 阅读提示：Methods之Pulse-chase BrdU labeling；Fig. 3b图注 |
| CBP–p53结合与p21调控 | PLA n=4只/组；p21与p53 IHC的CBPWT n=5、CBPAA n=6；CUT&RUN n=5只/组；抗CBP、抗p53抗体浓度 阅读提示：Methods之Proximity ligation assay与CUT&RUN assay；Fig. 3图注 |
| 类器官培养与成球效率 | 每孔接种400个隐窝；Matrigel 40 μL/孔；第6天检测；成球效率=(第6天类器官数/400)×100%；每只小鼠至少3个孔平均 阅读提示：Methods之Colonic crypt isolation and organoid culture；Fig. 4d图注 |
| versican回补与gefitinib处理 | 重组versican 100 ng/mL从第0天加入；gefitinib 1 μM从第3天加入；重组versican剂量选择依据50、100、200 ng/mL预实验 阅读提示：Methods之Cell lines and reagents；Fig. 6j–p图注 |
| 磷酸化模拟CBP突变体转染 | 每管1 μg质粒DNA；Lipofectamine Stem Transfection Reagent 1 μL；转染后600×g 32℃离心1 h、37℃ 2 h；第5天检测 阅读提示：Methods之Lipofectamine-mediated plasmid transfection；Fig. 7图注 |
| UC患者组织验证 | pCBP IHC每组n=9；CBP IHC正常n=8、UC n=7；PLA正常n=6、UC n=7；versican IHC正常n=5、UC n=10；Ki-67正常n=4、UC n=9；IKKα正常n=7、UC n=10 阅读提示：Fig. 8图注；Methods之Study approval |