单细胞转录组解析OSCC免疫微环境
明确早期和晚期OSCC的细胞组成及免疫抑制特征
对早期（I-II期，n=7）和晚期（III-IV期，n=9）OSCC患者新鲜组织进行单细胞RNA测序，质控后UMAP聚类鉴定10个细胞亚群，GSVA分析TCR信号和免疫抑制信号。
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ANXA1-FPRs信号介导的MDSCs空间异质性驱动口腔鳞状细胞癌进展中的免疫抑制
Spatial heterogeneity of MDSCs mediated by ANXA1-FPRs signaling drives immune suppression in OSCC progression.
实验完整度
高单细胞和空间转录组、mIHC、患者组织、自发和移植小鼠模型，含功能验证和机制验证
主要模型
OSCC患者组织（早期I-II期和晚期III-IV期） SCC7同种异体移植C3H/HeJ小鼠模型 Tgfbr1f/f; Ptenf/f; K14-CreERT2自发OSCC小鼠模型
重点核对
单细胞转录组：早期7例、晚期9例OSCC患者样本，质控标准为线粒体RNA<10%且检测基因数<2500 空间转录组：早期3例、晚期3例OSCC样本，RCTD反卷积和邻域分析定义肿瘤细胞富集区域（R2）和贫乏区域（R1） mIHC验证：抗PanCK、CD11b、CD8、ANXA1、FPR1、FPR2抗体染色，比较早期和晚期OSCC中MDSCs空间分布 小鼠治疗实验：SCC7细胞皮下接种C3H/HeJ小鼠，肿瘤体积达50 mm3后随机分组，IgG（10 μg/次）或anti-PD-1（200 μg/次）腹腔注射，WRW4（10 μg/次）或生理盐水，每2天一次共6次 生存分析：肿瘤体积超过800 mm3判定死亡，Log-rank检验比较组间生存
摘要
口腔鳞状细胞癌（OSCC）免疫治疗疗效有限是由免疫抑制性肿瘤微环境驱动的，但瘤内空间异质性在免疫应答中的作用仍不清楚。在此，我们采用单细胞和空间转录组学解析OSCC的细胞组成和空间组织。我们发现CD8+ T细胞在晚期OSCC中空间定位但功能受抑制，而髓源性抑制细胞（MDSCs）从早期OSCC的肿瘤核心浸润转变为晚期与CD8+ T细胞一起的边缘定位。ANXA1-FPR2信号介导肿瘤-MDSCs通讯，维持MDSCs募集和免疫抑制。使用拮抗剂破坏ANXA1-FPR2可增强OSCC小鼠模型中免疫检查点阻断治疗的疗效。这些发现揭示了MDSCs的空间动态作为免疫抑制和治疗耐药的关键调节因子，为改善OSCC免疫治疗结果提供了有希望的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- OSCC进展过程中肿瘤微环境的空间异质性如何影响免疫抑制，以及MDSCs的空间动态变化及其分子机制是什么。
- 核心机制
- 肿瘤细胞表达的ANXA1与MDSCs上的FPR1/2结合介导细胞通讯，早期通过ANXA1-FPR1招募MDSCs至肿瘤核心；晚期ANXA1表达下降，FPR2+ MDSCs代偿性增加并重分布至肿瘤边缘，增强对CD8+ T细胞的抑制。
- 主要证据
- 单细胞和空间转录组显示MDSCs从早期肿瘤核心向晚期边缘重分布；mIHC验证MDSCs与肿瘤细胞重叠减少与不良预后相关；FPR2拮抗剂WRW4联合anti-PD-1显著抑制小鼠肿瘤生长并延长生存。
- 研究意义
- 揭示MDSCs空间动态是免疫抑制和治疗耐药的关键调节因素，靶向ANXA1-FPR2轴可能改善OSCC免疫检查点阻断治疗疗效。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞通讯分析揭示ANXA1-FPRs配体受体对动态变化
探究上皮肿瘤细胞与髓系细胞间的通讯机制及随分期的变化
使用CellPhoneDB分析上皮细胞与髓系细胞的相互作用，重点分析ANXA1-FPR1/2/3配对，并结合髓系细胞亚群（MDSCs和TAM）的FPR1/2/3表达。
空间转录组解析MDSCs空间分布
在空间层面验证MDSCs在早期和晚期OSCC中的定位差异
对早期（n=3）和晚期（n=3）OSCC组织进行空间转录组测序，RCTD反卷积和邻域分析（intra/inter/distal spots）量化各细胞类型空间分布。
mIHC和免疫荧光验证MDSCs空间分布及临床相关性
在蛋白水平验证MDSCs在早期和晚期OSCC中的空间分布差异及其与预后的关系
对OSCC患者组织和自发小鼠模型进行mIHC/IF染色（PanCK、CD11b、CD8、ANXA1、FPR1、FPR2），量化MDSCs与肿瘤细胞区域重叠比例，并结合组织芯片生存分析。
FPR2拮抗剂联合anti-PD-1治疗小鼠OSCC模型
验证阻断ANXA1-FPR2信号能否增强免疫检查点阻断疗效
SCC7细胞皮下接种C3H/HeJ小鼠，肿瘤体积达50 mm3后随机分为四组：IgG+溶剂、IgG+WRW4、anti-PD-1+溶剂、anti-PD-1+WRW4，监测肿瘤生长和生存，终点进行mIHC分析MDSCs和CD8+ T细胞浸润。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织保存 | 组织保存液 | Miltenyi Biotec | 130-100-008 |
| 单细胞解离 | DMEM培养基 | Gibco | 11965092 |
| 牛血清白蛋白 | Gibco | 30066575 | |
| II型胶原酶 | Gibco | 17101015 | |
| DNase I | AppliChem | A3778 | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 2062476 | |
| 红细胞裂解 | 红细胞裂解液 | Miltenyi Biotec | 130-094-183 |
| 单细胞RNA-seq | MobiCube高通量单细胞3'转录组试剂盒V2.1 | -- | PN-S050200301 |
| MobiNova-100微流控平台 | -- | -- | |
| 空间转录组 | Visium CytAssist FFPE空间基因表达试剂盒 | 10× Genomics | PN-1000520 |
| mIHC | 兔抗泛角蛋白抗体 | Proteintech | 26411-1-AP |
| 兔抗CD8抗体 | Abcam | ab316778 | |
| 兔抗CD11b抗体 | Abcam | ab133357 | |
| 抗ANXA1抗体 | Abcam | ab214486 | |
| 抗FPR1抗体 | Abcam | ab113531 | |
| 抗FPR2抗体 | Abcam | ab203129 | |
| Cy3标记酪胺信号放大工作液 | Servicebio | G1223 | |
| FITC标记酪胺 | Servicebio | G1231 | |
| Cy5标记酪胺 | Servicebio | G1232 | |
| DAPI | Servicebio | G1012 | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 动物实验 | IgG同型对照 | Selleck | A2123 |
| WRW4（FPR2拮抗剂） | Selleck | S9818 | |
| 抗PD-1抗体 | Selleck | A2122 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞转录组样本和质控 | 早期OSCC n=7例、晚期OSCC n=9例；线粒体RNA<10%，检测基因数200-2500；Harmony去批次 阅读提示：Methods 'Single-cell RNA-seq and analysis'及Fig. 1a-c图注 |
| 空间转录组样本和反卷积 | 早期OSCC n=3例、晚期OSCC n=3例；RCTD version 1.1.0；肿瘤细胞富集区域（R2）定义为上皮细胞比例大于3/4四分位值 阅读提示：Methods 'Spatial transcriptome analysis'、'Deconvolution of spatial transcriptome data'及Fig. 3b、Fig. 4a图注 |
| mIHC和免疫荧光验证 | 抗体稀释比例1:200；人组织芯片I期n=22、IV期n=37；自发小鼠模型每组2个生物学重复；mIHC染色顺序和酪胺信号放大 阅读提示：Methods 'Multiplex immunohistochemical (mIHC) assay'及Fig. 5、Fig. 6图注 |
| 小鼠同种异体移植瘤治疗实验 | C3H/HeJ小鼠6周龄雄性，每组n=5；SCC7细胞1×10^6皮下注射；肿瘤体积达50 mm3后随机分组；anti-PD-1 200 μg/次、WRW4 10 μg/次、IgG 10 μg/次，每2天一次共6次，腹腔注射；肿瘤体积达1500 mm3或第20天安乐死 阅读提示：Methods 'Animal care and mouse models'及Fig. 8a图注 |
| 自发OSCC小鼠模型诱导 | Tgfbr1f/f; Ptenf/f; K14-CreERT2小鼠（FVB/N背景）；3月龄时他莫昔芬200 μL（10 μg/μL溶于玉米油）口腔给药连续5天 阅读提示：Methods 'Animal care and mouse models'及Fig. 5d图注 |