动物模型评估AmB对呼吸道病毒感染的影响
验证AmB在体内是否加重IAV和SARS-CoV-2感染及病理损伤。
建立IAV感染小鼠模型和SARS-CoV-2感染仓鼠模型，给予AmB或对照，监测体重、病毒载量、肾功能和肺组织病理。
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两性霉素B通过葡萄糖脑苷脂酶介导的神经酰胺重塑促进晚期内体成熟与融合从而增强呼吸道病毒入侵
Amphotericin B promotes respiratory viral entry by enhancing late endosomal maturation and fusion via glucocerebrosidase-mediated ceramide remodeling.
实验完整度
高含体外细胞系、假病毒、动物模型（小鼠和仓鼠）及回顾性临床队列，并完成GBA1敲除/敲低、CBE抑制、pull-down、SPR和脂质组学等功能与机制验证
主要模型
A549细胞系 293T细胞系及GBA1敲除293T细胞 IAV感染C57BL/6J小鼠模型 SARS-CoV-2感染金黄仓鼠模型
重点核对
AmB给药方案：小鼠和仓鼠腹腔注射1 mg/kg，病毒攻击前1 h给药，感染后24和72 h重复给药 病毒攻击剂量：小鼠鼻内接种IAV PR8 200 PFU；仓鼠鼻内接种SARS-CoV-2 Delta变异株105 TCID50 体外AmB预处理浓度1 μg/mL预处理1 h（部分细胞系为0.3 μg/mL）后进行病毒感染 GBA1功能验证：CRISPR-Cas9敲除、siRNA敲低及CBE（100 μM）抑制实验 回顾性队列：2016–2025年培养确诊肺曲霉病患者n=1,072，1:1倾向性评分匹配后每组n=116
摘要
呼吸道病毒感染，如流感和COVID-19，构成重大全球健康挑战。对于侵袭性肺曲霉病患者，继发病毒感染可导致临床结局显著恶化。尽管两性霉素B（AmB）仍是抗真菌治疗的基石，我们的研究却表明，它反而增强甲型流感病毒和SARS-CoV-2的入侵。机制上，AmB直接结合并激活葡萄糖脑苷脂酶，导致晚期内体中神经酰胺积累和RAB7上调，从而增强晚期内体成熟及与病毒的融合。在动物模型中，AmB治疗增强了甲型流感病毒感染小鼠和SARS-CoV-2攻击仓鼠的病毒感染，导致体重下降加速、病毒载量升高和组织损伤加重。一致地，在我们对培养确诊侵袭性肺曲霉病患者（2016–2025年，n=1,072）进行的倾向性评分匹配队列中，与其他抗真菌药相比，全身使用AmB与后续病毒感染发生率显著升高相关（21.55% vs. 7.76%，P=0.003），多变量分析进一步证实AmB为独立危险因素（校正OR=3.45，95% CI 2.20–5.41，P=7.174×10-8）。总之，我们的发现为指导抗真菌治疗提供了关键临床证据，并揭示葡萄糖脑苷脂酶是开发新型抗病毒策略的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 两性霉素B是否及如何影响甲型流感病毒和SARS-CoV-2等呼吸道病毒的感染，以及这种影响在动物模型和临床患者中是否具有相关性。
- 核心机制
- AmB直接结合并激活晚期内体中的葡萄糖脑苷脂酶（GCase），导致神经酰胺积累和RAB7上调，重塑晚期内体膜性质，从而增强晚期内体成熟及与病毒囊膜的融合，促进病毒入侵。
- 主要证据
- 体外细胞系和假病毒实验显示AmB增强IAV和SARS-CoV-2进入并依赖GCase；GBA1敲除/敲低和CBE抑制减弱AmB的增强效应；pull-down结合LC-MS/MS和SPR（KD=23 μM）证实AmB与GCase结合；脂质组学和蛋白质组学显示晚期内体神经酰胺增加及RAB7上调；小鼠和仓鼠模型显示AmB加重病毒感染和肺损伤；回顾性队列显示AmB与后续病毒感染风险升高相关（21.55% vs. 7.76%）。
- 研究意义
- 研究提供了指导抗真菌治疗的临床证据，提示需重新评估AmB在侵袭性肺曲霉病及病毒合并感染中的使用，并揭示GCase作为开发新型抗病毒策略的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
回顾性临床队列分析AmB与继发病毒感染的关系
在临床人群中分析全身使用AmB是否与后续呼吸道病毒感染风险相关。
纳入2016–2025年培养确诊肺曲霉病并接受全身抗真菌治疗的成人住院患者，比较AmB组与非AmB组后续实验室确诊呼吸道病毒感染发生率，并进行倾向性评分匹配和多变量分析。
体外验证AmB对IAV感染的增强作用及入侵阶段
确定AmB是否增强IAV感染以及作用于病毒入侵的哪个阶段。
用AmB预处理A549等细胞后感染IAV或HIV/IAV假病毒，检测NP RNA和蛋白、病毒结合、内吞、内体运输和核输入。
验证AmB对晚期内体融合的特异性促进作用
明确AmB是否特异性促进病毒与晚期内体膜的融合而非早期内体或质膜融合。
使用双荧光标记病毒融合实验、酸性旁路实验、LysoSensor pH测定以及依赖不同内体阶段的假病毒评价AmB对融合的影响。
鉴定AmB在晚期内体中的结合靶点
寻找晚期内体中与AmB直接结合的蛋白。
合成生物素化AmB，与纯化的晚期内体孵育，链霉亲和素磁珠pull-down，经SDS-PAGE银染和LC-MS/MS鉴定差异条带，并用免疫印迹和SPR验证。
验证GCase激活及神经酰胺在AmB增强病毒入侵中的作用
确定AmB是否通过激活GCase和增加晚期内体神经酰胺促进病毒入侵。
检测AmB处理后GCase活性和晚期内体神经酰胺水平，利用GBA1敲除、siRNA敲低和CBE抑制评估GCase在AmB增强病毒入侵中的必要性。
分析AmB对晚期内体蛋白组成的调控及GCase依赖性
明确AmB是否改变晚期内体蛋白组成以及该改变是否依赖GCase。
对AmB处理并感染IAV的A549细胞分离早期和晚期内体进行定量蛋白质组学，免疫印迹验证RAB7等蛋白变化，并比较野生型和GBA1敲除293T细胞晚期内体蛋白水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| MCDB 131培养基 | Gibco | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 重组人表皮生长因子 | Gibco | -- | |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 药物处理 | 两性霉素B | MedChemExpress | HY-B0221 |
| 伏立康唑 | MedChemExpress | HY-76200 | |
| 艾萨康唑 | MedChemExpress | HY-14273 | |
| 泊沙康唑 | MedChemExpress | HY-17373 | |
| 伊曲康唑 | MedChemExpress | HY-17514 | |
| 卡泊芬净 | MedChemExpress | HY-17006 | |
| 巴弗洛霉素A1 | MedChemExpress | HY-100558 | |
| 氯化铵 | MedChemExpress | HY-Y1269 | |
| 制霉菌素 | MedChemExpress | HY-17409 | |
| Importazole | MedChemExpress | HY-101091 | |
| Pitstop 2 | MedChemExpress | HY-115604 | |
| EIPA | MedChemExpress | HY-101840 | |
| 甲基-β-环糊精 | MedChemExpress | HY-101461 | |
| 病毒定量 | HIV-1 p24抗原ELISA试剂盒 | Revvity | NEK050 |
| 假病毒检测 | 荧光素酶细胞培养裂解试剂 | Promega | E1531 |
| 荧光素酶检测系统底物 | Promega | E4550 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8细胞活力检测试剂盒 | Dojindo Laboratories | CK04 |
| RNA干扰 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 13778150 |
| siRNA-Mate转染试剂 | GenePharma | 04027 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596018CN |
| QIAamp病毒RNA小量提取试剂盒 | QIAGEN | 52904 | |
| cDNA合成 | Hifair III第一链cDNA合成预混液 | Yeasen | 11141ES10 |
| RT-qPCR | PowerUp SYBR Green预混液 | Thermo Fisher Scientific | A25742 |
| Western blot | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 |
| Immobilon Western化学发光HRP底物 | Merck Millipore | WBKLS0500 | |
| 病毒融合实验 | SP-DiOC18 | Thermo Fisher Scientific | D7778 |
| R18 | -- | O246 | |
| 酸性细胞器pH测定 | LysoSensor黄/蓝DND-160 | Thermo Fisher Scientific | L7545 |
| 莫能菌素 | Selleck | S2324 | |
| 内吞途径实验 | Alexa Fluor 488标记转铁蛋白 | Thermo Fisher Scientific | T13342 |
| 四甲基罗丹明标记70 kDa葡聚糖 | Thermo Fisher Scientific | D1818 | |
| Alexa Fluor 555标记霍乱毒素B亚基 | Thermo Fisher Scientific | C22843 | |
| 流式细胞术 | LIVE/DEAD可固定近红外(876)死细胞染色试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | L34982 |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488标记驴抗小鼠IgG | Thermo Fisher Scientific | A32766 |
| Alexa Fluor 555标记驴抗小鼠IgG | Thermo Fisher Scientific | A31570 | |
| Alexa Fluor 555标记驴抗兔IgG | Thermo Fisher Scientific | A32794 | |
| Alexa Fluor 488标记链霉亲和素 | BioLegend | 405235 | |
| Pull-down | 链霉亲和素磁珠 | MedChemExpress | HY-K0208 |
| SPR | 重组人葡萄糖脑苷脂酶蛋白 | MedChemExpress | HY-P75786 |
| GCase活性检测 | 葡萄糖脑苷脂酶活性检测试剂盒 | Abcam | ab273339 |
| 免疫组织化学 | 抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白抗体 | Sino Biological | 40143-R001 |
| HRP标记抗兔IgG二抗 | Solarbio | SE134 | |
| Western blot | 小鼠抗IAV NP抗体 | Abcam | ab20343 |
| 小鼠抗β-actin抗体 | Sigma-Aldrich | A5316 | |
| 小鼠抗Lamin A/C抗体 | Cell Signaling Technology | 4777S | |
| 兔抗RAB5A抗体 | Cell Signaling Technology | 2143 | |
| 兔抗RAB11抗体 | Proteintech | 15903-1-AP | |
| 兔抗RAB7抗体 | Abcam | ab137029 | |
| 兔抗LAMP1抗体 | Cell Signaling Technology | 9091S | |
| 兔抗LAMP2抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA1-655 | |
| 兔抗NPC1抗体 | Abcam | ab134113 | |
| 兔抗葡萄糖脑苷脂酶抗体 | Abcam | ab128879 | |
| 免疫荧光 | 兔抗EEA1抗体 | Cell Signaling Technology | 3288 |
| 生物素化接骨木凝集素 | Vector | B-1305-2 | |
| 病毒结合实验 | 神经氨酸酶 | Merck | 11080725001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物感染模型 | 小鼠品系C57BL/6J、6–8周龄、雄性；仓鼠品系LVG Golden Syrian；IAV PR8剂量200 PFU/30 μL；SARS-CoV-2 Delta变异株剂量105 TCID50/0.1 mL；AmB腹腔注射1 mg/kg于病毒攻击前1 h及感染后24和72 h给药；每组n=5 阅读提示：Methods中In vivo experiments小节及Fig. 1图注 |
| 回顾性临床队列 | 纳入标准为培养确诊肺曲霉病并接受全身抗真菌治疗的成人住院患者；AmB组定义为连续全身使用AmB≥3天；倾向性评分匹配比例1:1；匹配后每组n=116；主要结局为抗真菌治疗启动后实验室确诊呼吸道病毒感染 阅读提示：Methods中Retrospective cohort study小节及Results中队列分析段落 |
| 体外IAV感染与入侵实验 | A549细胞预处理1 μg/mL AmB 1 h；IAV PR8感染MOI=0.1（部分实验MOI=1）；所有入侵相关实验使用50 μg/mL CHX；病毒结合在4 °C进行1 h；假病毒感染结果在48 hpi检测荧光素酶活性 阅读提示：Methods中Pseudovirus infection assay、Time-of-addition assay、Viral binding, internalization, and endosomal trafficking assays小节及Fig. 2图注 |
| 病毒融合实验 | PR8双标记使用0.4 μM R18和0.2 μM SP-DiOC18；病毒-染料混合物室温涡旋1 h；融合在37 °C进行；于1.5和3 hpi成像；融合效率以Manders’ M2系数定量 阅读提示：Methods中Virus fusion assay小节及Fig. 3G、H图注 |
| GCase靶点鉴定与功能验证 | AmB-biotin与晚期内体孵育1 h；竞争组加入500 nmol游离AmB；SPR固定重组人GCase 50 μg/mL，AmB浓度梯度0–100 μM；CBE使用100 μM；GBA1敲除293T细胞使用0.3 μg/mL AmB预处理 阅读提示：Methods中Pull-down and LC–MS/MS、Surface plasmon resonance (SPR)、In vitro pharmacological activity assay小节及Fig. 4、Fig. 5图注 |
| 晚期内体蛋白质组与脂质组分析 | A549细胞1 μg/mL AmB预处理1 h后IAV MOI=1感染4 h；晚期内体经蔗糖密度超速离心分离；蛋白质组学采用DIA；脂质组学脂质浓度以μmol/g蛋白归一化 阅读提示：Methods中Isolation of subcellular fractions、Lipidomics analyses小节及Fig. 6A–D图注 |