HCC酪氨酸代谢重编程鉴定
确定HCC中酪氨酸水平及摄取和代谢变化
对人及Myc/Alb-cre小鼠肿瘤与正常肝组织进行靶向代谢组学；用3H-酪氨酸和13C-酪氨酸示踪检测摄取和代谢流；检测转运体与代谢酶表达。
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靶向依赖tRNA的酪氨酸利用揭示肝细胞癌的代谢脆弱性
Targeting tRNA-dependent tyrosine usage unveils a metabolic vulnerability in hepatocellular carcinoma.
实验完整度
高含体外细胞、三种小鼠HCC模型、患者组织、多组学及CRISPR筛选，并有功能与机制验证
主要模型
人HCC细胞系SNU398、SNU449、PLCPRF5、HCCLM3 Myc/Alb-cre自发HCC小鼠 DEN诱导HCC小鼠 BALB/c裸鼠肝内注射人HCC细胞模型
重点核对
Myc/Alb-cre小鼠饮食酪氨酸0%、100%、500%分组及肿瘤负荷、生存期终点 DEN模型25 mg/kg腹腔注射及AKT/NRASG12V水动力注射模型 AAV8-shYARS1按1×10^12 genome copies/只尾静脉注射 FjTAL按10、25、50 mg/kg腹腔注射及tyrosinol 500 mg/kg/d口服灌胃 sorafenib或venetoclax 30 mg/kg/d口服灌胃4周
摘要
癌细胞重编程翻译和代谢以驱动肿瘤发生。在此，我们证明肝细胞癌（HCC）表现出矛盾的现象：尽管摄取增加且代谢减少，仍维持低酪氨酸水平，并通过MYC驱动的酪氨酰-tRNA合成酶1（YARS1）和tRNA-TyrGUA上调将酪氨酸重定向至翻译。通过饮食限制、YARS1/tRNA-TyrGUA敲除、酪氨酸降解（TAL）或YARS1抑制（tyrosinol）来限制酪氨酸翻译可用性（RTTA）会扰乱这一适应性，导致肿瘤发生减轻和生存期延长。机制上，RTTA减少线粒体复合物I亚基NDUFB8和脂质调节因子SCD1的酪氨酸密码子依赖性翻译，导致复合物I错误组装、氧化磷酸化失败和脂质过氧化诱导的铁死亡。全基因组CRISPR筛选发现，通过遗传操作或药物治疗缺失GPX4和BCL2可增强RTTA抑制肝细胞癌发生的能力。我们的发现确立了RTTA作为靶向酪氨酸依赖性的治疗策略，并强调在肝癌中联合靶向翻译-代谢串扰和铁死亡通路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肝细胞癌中酪氨酸利用途径如何重编程，以及限制酪氨酸翻译可用性能否抑制肿瘤发生。
- 核心机制
- MYC上调YARS1和tRNA-TyrGUA，促进酪氨酸转向翻译；限制酪氨酸翻译可用性降低NDUFB8和SCD1的酪氨酸密码子依赖性翻译，导致线粒体复合物I错误组装、氧化磷酸化失败和脂质过氧化诱导的铁死亡。
- 主要证据
- 人及小鼠HCC组织代谢组学、3H/13C酪氨酸示踪、tRNA测序与Northern blot、核糖体 profiling、多组学、CRISPR筛选，以及饮食限制、YARS1/tRNA-TyrGUA敲低、FjTAL和tyrosinol处理的小鼠肿瘤模型。
- 研究意义
- 提出RTTA作为靶向酪氨酸依赖性的治疗策略，并提示联合靶向翻译-代谢串扰与铁死亡通路在肝癌治疗中的潜在应用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
饮食酪氨酸限制的体内抗肿瘤验证
验证酪氨酸水平对HCC发生和已形成肿瘤的影响
在Myc/Alb-cre、DEN诱导和裸鼠肝内注射三种HCC模型中给予酪氨酸0%、100%或500%饮食，检测肿瘤负荷和生存期。
MYC-YARS1轴及酪氨酸翻译利用验证
明确HCC中酪氨酸转向蛋白合成及MYC对YARS1的调控
3H-酪氨酸掺入核糖体和蛋白检测；tRNA RT-qPCR和Northern blot检测tRNA-TyrGUA；ChIP和荧光素酶报告验证MYC结合YARS1启动子；YARS1敲低体内验证。
RTTA下游翻译靶点及机制解析
鉴定酪氨酸限制敏感翻译的靶蛋白及功能后果
整合转录组、翻译组、蛋白组和代谢组；核糖体 profiling、报告基因、核糖体免疫沉淀验证NDUFB8和SCD1翻译；检测复合物I组装、活性和OCR及脂质过氧化。
全基因组CRISPR筛选及联合治疗验证
寻找增强RTTA疗效的遗传互作及联合药物
在SNU398细胞进行Brunello文库全基因组CRISPR敲除筛选；验证GPX4、SLC7A11、BCL2敲低及RSL3、Erastin、venetoclax、sorafenib联合效果；体内联合sorafenib或venetoclax。
FjTAL和tyrosinol治疗验证
评估降解酪氨酸和抑制YARS1的治疗效果
纯化FjTAL并检测其与酪氨酸结合及降解活性；FjTAL和tyrosinol处理细胞及Myc/Alb-cre小鼠，检测肿瘤负荷、生存期、线粒体功能和铁死亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 二乙基亚硝胺 | Sigma | N0676 |
| 药物处理 | 酪氨醇 | Sigma | 469998 |
| 细胞培养 | Ⅳ型胶原酶 | Sigma | C5138 |
| Percoll缓冲液 | Sigma | P1644 | |
| 胎牛血清 | Vazyme | F101-01 | |
| 链霉素-青霉素 | Viva Cell | C3420-0100 | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668500 |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000150 | |
| 病毒感染 | 聚凝胺 | Beyotime | C0351 |
| 药物处理 | RSL3 | MCE | HY-100218A |
| Erastin | MCE | HY-15763 | |
| 索拉非尼 | MCE | HY-10201 | |
| 维奈克拉 | MCE | HY-15531 | |
| RNA提取 | TRIZOL试剂 | Invitrogen | 15596018CN |
| 逆转录 | HiScript III逆转录试剂盒 | Vazyme | R323 |
| RT-qPCR | ChamQ SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q412 |
| tRNA定量 | tRNA定量试剂盒 | Arraystar | AS-FS-004 |
| MLV逆转录酶试剂盒 | Invitrogen | 28025013 | |
| Northern blot | Northern印迹试剂盒 | Beyotime | R0220 |
| 2×RNA天然上样缓冲液 | Beyotime | R0221 | |
| 免疫印迹 | 蛋白酶抑制剂 | Roche | 46931320001 |
| Pierce™ ECL Western印迹底物 | Thermo Scientific | 32209 | |
| 抗SLC7A5抗体 | Proteintech | 28670-1-AP | |
| 抗SLC38A9抗体 | Proteintech | 21871-1-AP | |
| 抗SLC43A1抗体 | Proteintech | 10444-1-AP | |
| 抗TAT抗体 | Thermo fisher | PA5-26541 | |
| 抗HPD抗体 | Proteintech | 67552-1-Ig | |
| 抗HGD抗体 | Proteintech | 16465-1-AP | |
| 抗GSTZ1抗体 | Proteintech | 14889-1-AP | |
| 抗FAH抗体 | Proteintech | 14928-1-AP | |
| 抗YARS1抗体 | Thermo fisher | PA5-53883 | |
| 抗NDUFB8抗体 | Proteintech | 14794-1-AP | |
| 抗SDHB抗体 | Proteintech | 10620-1-AP | |
| 抗UQCRC1抗体 | Proteintech | 10620-1-AP | |
| 抗MTCO2抗体 | Proteintech | 55070-1-AP | |
| 抗ATP5A1抗体 | Proteintech | 14676-1-AP | |
| 抗SCD1抗体 | Proteintech | 28678-1-AP | |
| 抗4-HNE抗体 | JaICA | MHN-20P | |
| 抗组蛋白H3抗体 | CST | 4499 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | TransGen Biotech | HC201-01 | |
| 抗兔IgG二抗 | LABLEAD | RN0100 | |
| 抗小鼠IgG二抗 | LABLEAD | MN0100 | |
| 蓝白非变性电泳 | 洋地黄皂苷 | Beyotime | ST1272 |
| 2×蓝白非变性PAGE上样缓冲液 | Beyotime | P0761 | |
| 3–12%蓝白非变性预制胶 | Beyotime | P0546 | |
| 流式分析 | Annexin-V FITC试剂盒 | Beyotime | C0162 |
| MitoSOX Red线粒体ROS探针 | MCE | HY-D1055 | |
| BODIPY 581/591 C11脂质过氧化探针 | Thermo Scientific | D3861 | |
| 酪氨酸示踪 | L-[环3,5-3H]-酪氨酸 | American Radiolabelled Chemicals, Inc. | ART 0195 |
| SOLVABLE组织溶解液 | PerkinElmer | 6NE9100 | |
| 核糖体提取试剂盒 | BestBio | BB-36061 | |
| 代谢流分析 | L-酪氨酸（环-13C6） | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1542-PK |
| Seahorse检测 | XFe96细胞培养微孔板 | Agilent | 102416-100 |
| Seahorse XF基础培养基 | Agilent | 102353-100 | |
| 寡霉素 | Abcam | ab141829 | |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| 鱼藤酮 | Sigma | R8875 | |
| 焦磷酸检测 | PhosphoWorks™荧光焦磷酸检测试剂盒 | AAT Bioquest | 21614 |
| ChIP | EZ-CHIPTM实验试剂盒 | Sigma | 17-371 |
| 荧光素酶报告 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 |
| 核糖体免疫沉淀 | Magna RIP™试剂盒 | Sigma-Aldrich | 17-371 |
| Flag亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A220 | |
| RNA清洁浓缩柱试剂盒 | Zymo Research Corp | R1017 | |
| TUNEL检测 | 一步法TUNEL凋亡检测试剂盒 | Beyotime | C1088 |
| 免疫荧光 | DAPI | Beyotime | P0131 |
| 油红O染色 | 油红O染色试剂盒 | Solarbio | G1262 |
| 线粒体复合物活性检测 | 线粒体复合物活性检测试剂盒 | Solarbio | BC0515, BC3235, BC3245, BC0945, BC1440 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 饮食酪氨酸限制模型 | 饮食酪氨酸比例0%、100%（0.4% wt/wt）和500%（2%酪氨酸）；谷氨酸调整蛋白/氮含量；三种HCC模型分组与n数 阅读提示：Methods动物实验及Fig. 1d–g、Supplementary Fig. 1 |
| Myc/Alb-cre与DEN诱导HCC模型 | Myc/Alb-cre 12周内自发成瘤；DEN 14日龄雄性小鼠25 mg/kg腹腔注射；仅用雄性小鼠 阅读提示：Methods动物实验及Fig. 1d |
| YARS1/tRNA-TyrGUA敲低体内实验 | AAV8-shYARS1 1×10^12 GC/只尾静脉注射；HCCLM3肝内注射1×10^6细胞/50 μL；shRNA序列 阅读提示：Methods动物实验、Supplementary Data 1及Fig. 2k–p |
| RTTA体外处理与多组学 | SNU398等细胞酪氨酸0%培养基；处理48 h；核糖体 profiling、RNA-seq、蛋白组和代谢组样本量与重复数 阅读提示：Methods细胞培养、Ribo-seq、蛋白组和代谢组部分 |
| FjTAL与tyrosinol给药 | FjTAL 10、25、50 mg/kg腹腔注射，每2天一次；tyrosinol 500 mg/kg/d口服灌胃；给药时长 阅读提示：Methods动物实验及Fig. 5、Fig. 6 |
| 联合用药实验 | sorafenib或venetoclax 30 mg/kg/d口服灌胃4周，8周龄起；溶剂组成；联合RTTA的分组与n数 阅读提示：Methods动物实验及Fig. 4i–m |