重组CCDC6-RET蛋白表达与纯化
获得高纯度、单分散且具有催化完整性的重组融合蛋白用于后续表征
利用杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中表达CCDC6-RET（CCDC6 aa 1-101与RET aa 713-1072融合），经镍亲和层析、谷胱甘肽亲和层析、3C蛋白酶酶切及尺寸排阻色谱纯化。
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致癌性CCDC6-RET融合蛋白是一种双ATP和ADP依赖性激酶
The oncogenic CCDC6-RET fusion protein is a dual ATP- and ADP-dependent kinase.
实验完整度
高重组蛋白生化酶学、LC-MS/MS磷酸化、交联质谱、EM/SAXS结构、MD模拟多层级验证
主要模型
Sf9昆虫细胞表达的重组CCDC6-RET融合蛋白 RET催化核心片段（aa 713-1072） CCDC6-RET ΔCT缺失突变体
重点核对
重组CCDC6-RET蛋白纯度与二聚体状态：质量光度法测定为101.2±2.2 kDa二聚体 ATP酶动力学参数：CCDC6-RET的KM为133.25±13 μM，RET 713-1072为429.28±77 μM 自磷酸化时间进程：1 μM蛋白，1 mM ATP，2 mM MgCl2，0–30 min ADP依赖性：1 mM ADP可驱动CCDC6-RET自磷酸化，但速率慢于ATP 激活环Tyr905突变（Y905F）导致肽底物催化活性丧失
摘要
涉及蛋白激酶的基因融合产物是已知的人类癌症驱动因素，也是个性化治疗的靶点，但控制其功能的结构和分子决定因素在很大程度上尚未被探索。在这里，我们展示CCDC6-RET融合蛋白，一种肺癌和甲状腺癌的驱动因素和治疗靶点，是一种高活性的二聚体激酶。时间分辨质谱结合稳健的生化和生物物理表征揭示，CCDC6-RET作为一种双ATP和ADP依赖性激酶，能够结合两种核苷酸并将其用作磷酸基团供体。我们还发现C端和激活片段之间的串扰控制融合蛋白的加工和催化活性。此外，结合单颗粒电子显微镜、小角X射线散射和计算机分子动力学模拟，生成了CCDC6-RET同源二聚体的3D结构组装。我们的结构模型与交联质谱数据表明，CCDC6-RET在非活性状态下形成面对面二聚体，其特征是分子间交联的激活片段。核苷酸结合后，催化结构域摆开，快速的激活环磷酸化可能由顺式机制驱动。我们的工作揭示了控制CCDC6-RET自激活机制的结构和分子决定因素。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CCDC6-RET融合蛋白的催化功能、自激活机制及其结构和分子决定因素是什么？
- 核心机制
- CCDC6-RET以面对面二聚体形式存在，核苷酸结合后催化结构域摆开，激活环磷酸化可能通过顺式机制驱动；C端与激活片段串扰，Tyr905控制催化活性，Tyr900影响蛋白加工折叠。
- 主要证据
- 重组蛋白生化酶学显示CCDC6-RET是双ATP/ADP依赖性激酶；LC-MS/MS鉴定自磷酸化位点；交联质谱、EM、SAXS和MD模拟支持非活性状态面对面二聚体及活性状态结构域摆开的模型；Tyr905突变体酶学实验证明其催化必要性。
- 研究意义
- 揭示了CCDC6-RET自激活的结构和分子决定因素，为其他RET融合产物的结构和功能研究提供了框架，并对药物发现具有潜在意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CCDC6-RET自磷酸化位点鉴定
鉴定CCDC6-RET自磷酸化位点及其动态变化
采用时间分辨LC-MS/MS监测体外自磷酸化反应（0–30 min），并结合磷酸化特异性抗体Western blot验证。
CCDC6-RET双ATP/ADP依赖性验证
验证CCDC6-RET是否能以ADP作为磷酸基团供体
通过酶动力学测定ATP的KM和kcat/KM，利用DSF测定ATP和ADP的结合亲和力，并通过放射性标记的ADP（β-ADP-P33）和ATP（γ-ATP-P32）自磷酸化实验验证磷酸基团转移。
激活环Tyr905功能验证
验证激活环Tyr905对CCDC6-RET催化活性的必要性
构建Y900F、Y905F、Y900/905F等激活环突变体，在全长和ΔCT背景下进行自磷酸化实验和肽底物酶动力学测定。
CCDC6-RET同源二聚体结构解析
解析CCDC6-RET同源二聚体的三维结构及构象变化
结合负染电子显微镜单颗粒分析、小角X射线散射（SAXS）、交联质谱（DSBU交联剂）和分子动力学模拟（300 ns）构建非活性和活性状态的结构模型。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达 | flashBAC杆状病毒表达系统 | Oxford Expression Technologies | -- |
| Sf900-II培养基 | Gibco | -- | |
| Fugene转染试剂 | -- | -- | |
| 蛋白纯化 | 谷胱甘肽琼脂糖4快速流 | Cytiva | -- |
| Superdex 200 3.2/300色谱柱 | GE Healthcare | -- | |
| Superdex 200 16/60色谱柱 | GE Healthcare | -- | |
| Superdex 200 10/300色谱柱 | GE Healthcare | -- | |
| Western blot | 磷酸化酪氨酸抗体（pTyr-100） | CST | 9411 |
| RET抗体（D3D8R） | CST | 14698 | |
| 磷酸化RET Tyr905抗体 | CST | 3221 | |
| 磷酸化RET Tyr1015抗体 | Abcam | 74154 | |
| 磷酸化RET Tyr1062抗体 | Abcam | 51103 | |
| 抗兔IgG DyLight 800偶联物 | CST | 5151 | |
| 抗小鼠IgG DyLight 680偶联物 | CST | 5470 | |
| DSF | Tycho NT.6仪器 | NanoTemper Technologies | -- |
| 质量光度法 | MPone仪器 | Refeyn | -- |
| 酶动力学 | CLARIOstar Plus酶标仪 | BMG LABTECH | -- |
| LC-MS/MS | Q Exactive Plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 交联质谱 | DSBU交联剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Exploris480质谱仪 | Thermo | -- | |
| 放射性自磷酸化 | ATP γP32 | Revvity | -- |
| ADP βP33 | Hartmann Analytics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组蛋白表达与纯化 | Sf9细胞密度0.3–0.5×10^6 cells/mL，感染72–96小时，纯化产量0.3–0.4 mg/L 阅读提示：Methods中Heterologous protein expression in insect cells和Protein purification小节 |
| 自磷酸化时间进程 | CCDC6-RET 1 μM，ATP 1 mM，MgCl2 2 mM，反应时间0–30 min 阅读提示：Methods中In vitro phosphorylation assays小节及Fig. 2a图注 |
| 酶动力学测定 | CCDC6-RET 0.25 μM，ATP浓度0–2.5 mM，肽底物EAIYAAPFAKKK 1.35 mM 阅读提示：Methods中Enzyme kinetic assays小节及Fig. 1h、Fig. 3b图注 |
| 交联质谱 | CCDC6-RET 6 μM，DSBU 200倍摩尔过量，室温50 min，三次独立重复 阅读提示：Methods中Crosslinking mass spectrometry小节 |
| 负染电子显微镜 | CCDC6-RET 0.7 μM，碳膜400目铜网，1%醋酸铀染色1 min，120 keV 阅读提示：Methods中Negative staining and electron microscopy小节 |
| SAXS | CCDC6-RET ΔCT 5 mg/mL，Superdex 200 Increase 3.2柱，X射线波长1 Å 阅读提示：Methods中Small angle X-ray scattering小节 |
| 分子动力学模拟 | 300 ns模拟时长，ff14SB力场，300 K，TIP3P水模型 阅读提示：Methods中Structural modeling and molecular dynamics simulations小节 |