pgEpiSCs向脂肪祖细胞及脂肪细胞的无血清定向分化
验证pgEpiSCs能否在无血清条件下定向分化为功能性脂肪细胞。
依次使用ADM I至ADM V培养基进行阶段特异性诱导，通过qRT-PCR、免疫荧光、Oil Red O、BODIPY和Nile red染色检测脂肪分化标志物和脂滴积累。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
通过稳定的猪外胚层干细胞多向分化生成多组织细胞培养肉
Generation of multitissue cell-cultivated meat via multidirectional differentiation of stable porcine epiblast stem cells.
实验完整度
高包含体外定向分化、三维悬浮/支架培养、转录组测序及营养与质构分析等多层级验证
主要模型
猪原肠胚前外胚层干细胞（pgEpiSCs） pgEpiSC来源的肌祖细胞、脂肪祖细胞和血管祖细胞 无支架三维悬浮球体培养体系 植物源可食用三维支架培养体系
重点核对
pgEpiSCs在无饲养层条件下以2×10^5细胞/孔接种于6孔板，添加10 μM Y-27632进行分化诱导 脂肪分化：ADM I（3 μM CHIR99021 + 10 μM SB431542）处理3天，ADM II（3 μM CHIR99021 + 0.5 μM LDN193189 + 20 ng/mL FGF2）处理9天，ADM III（10 ng/mL FGF2 + 10 ng/mL hEGF）处理6天，ADM IV（1% ITS + 1 μM罗格列酮 + 500 μM IBMX + 1 μM Dex + 10 μg/mL胰岛素）处理6天，ADM V（10 μg/mL胰岛素）维持4-7天 血管分化：VDM I处理1天，VDM II处理5天，VDM III持续培养；Tube formation实验使用1×10^4细胞/孔接种于Matrigel，孵育4-6小时 肌分化：MDM I处理3天，MDM II处理，MDM III处理2天，MDM IV处理4天，MDM V维持20-25天 三维悬浮球体形成：细胞密度5.0×10^5/mL，水平旋转器70 rpm，37°C、5% CO2、100%湿度
摘要
细胞培养肉已成为可持续蛋白质生产的一种替代途径，但复制传统肉类的质地和复杂组成仍是一项关键挑战。在此，我们开发了一种高效方法，通过利用无血清和无动物源成分的分化体系，将猪原肠胚前外胚层干细胞定向分化为具有协同功能的肌肉、脂肪和内皮细胞，从而生产多组织工程肉。这三种细胞祖细胞在无支架三维悬浮体系中表现出自主的细胞间识别和共培养相容性，能够自发形成组织模拟球体，并具有增强的细胞增殖效率。多组织培养肉产品再现了传统猪肉的质地特性，并允许进行营养调控。该平台通过将可扩展的三维悬浮培养与无血清、物种特异性干细胞多向分化相结合，克服了当前培养肉技术的主要局限性，为多组织细胞培养肉的发展提供了途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否利用猪多能干细胞通过无血清多向分化体系生成具有肌肉、脂肪和内皮等多种组织成分的细胞培养肉，并复现传统肉类的质地和营养特性？
- 核心机制
- 猪pgEpiSCs在无血清、无动物源成分的阶段特异性定向分化体系下，分别被诱导为肌祖细胞、脂肪祖细胞和血管祖细胞；这些祖细胞在无支架三维悬浮培养中通过自主细胞间识别和自组装形成多组织球体，并增强细胞增殖效率。
- 主要证据
- 通过qRT-PCR、免疫荧光、RNA-Seq和GO/GSEA分析验证了pgEpiSCs向肌肉、脂肪和内皮细胞的分化；三维悬浮培养形成直径约1000 μm、细胞密度达1.35×10^8/mL的多组织球体，免疫染色证实LD、SMF和EC共存；营养成分分析和质构分析表明培养肉氨基酸比例接近天然肉、PUFA/SFA比值约高两倍，质地与猪肉香肠相似。
- 研究意义
- 该平台将可扩展的三维悬浮培养与无血清、物种特异性干细胞多向分化相结合，为营养定制化和生态可持续的多组织细胞培养肉生产提供了技术途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
pgEpiSCs向血管细胞的无血清定向分化及功能验证
验证pgEpiSCs能否分化为内皮细胞和周细胞，并具备血管功能。
使用VDM I、VDM II和VDM III进行单层逐步分化，通过免疫荧光检测CD31/eNOS和αSMA，Tube formation实验和DiI-Ac-LDL摄取实验验证功能。
pgEpiSC来源肌祖细胞与脂肪祖细胞的二维和三维支架共培养
验证肌源和脂肪源祖细胞在共培养体系中的相容性及共分化能力。
在二维单层中以不同比例混合肌祖细胞和脂肪祖细胞进行共分化，并接种于植物源可食用三维支架中培养，通过染色和qRT-PCR检测成熟标志物。
三维悬浮培养形成肌、脂肪和血管单组织球体
验证各类型祖细胞在无支架三维悬浮体系中能否长期扩增并自组装为球体。
将pgMPCs、pgAPCs和pgVPCs分别以5.0×10^5/mL密度接种于非粘附培养皿，置于水平旋转器上培养，监测球体直径、活力和分化标志物表达。
三维多谱系共培养自组装生成多组织球体
验证肌、脂肪和血管祖细胞能否在三维悬浮体系中共组装为多组织球体，并评估其组织复杂性和营养特性。
将pgMPCs、pgAPCs和pgVPCs按比例混合接种于三维悬浮体系，通过HE染色、免疫荧光、qRT-PCR和RNA-Seq检测多组织结构和标志物表达，并进行氨基酸、脂肪酸和质构分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Accutase细胞解离试剂 | Gibco | A11105-01 |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 | |
| 脂肪分化诱导 | CHIR99021 | -- | -- |
| SB431542 | -- | -- | |
| LDN193189 | -- | -- | |
| 成纤维细胞生长因子2 | PeproTech | 100-18B | |
| 人表皮生长因子 | -- | -- | |
| 罗格列酮 | -- | -- | |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Sigma | I5879 | |
| 地塞米松 | Sigma | D4902 | |
| 胰岛素 | Sigma | I6634 | |
| 细胞培养 | TrypLE细胞解离试剂 | Gibco | 12605010 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | Gibco | C14190500CP | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| DMEM/F12培养基 | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
| 非必需氨基酸 | Thermo Fisher Scientific | 1140-050 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 16000-044 | |
| 脂肪染色 | BODIPY 493/503 | Duofluor | P10051-100 |
| 油红O溶液 | Sigma-Aldrich | O1391 | |
| 尼罗红 | Sigma-Aldrich | 19123 | |
| 血管功能检测 | Matrigel基质胶 | -- | -- |
| 人源DiI标记乙酰化低密度脂蛋白 | YEASEN | 20606ES76 | |
| 碱性磷酸酶染色 | 碱性磷酸酶染色试剂盒 | Millipore | SCR004 |
| 核型分析 | KaryoMAX秋水仙酰胺溶液 | Gibco | 15210-040 |
| 快速吉姆萨染色试剂盒 | BBI Life Science | E6073141 | |
| RNA提取与逆转录 | RNA prep pure细胞/细菌试剂盒 | TIANGEN | DP430 |
| Hifair® III第一链cDNA合成预混液 | YEASEN | 11141ES60 | |
| qRT-PCR | 2× RealStar Green Power预混液 | GenStar | A311-05 |
| LightCycler 480 II实时荧光定量PCR系统 | Roche | -- | |
| 免疫荧光染色 | Tween 20 | Solarbio | T8220 |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A1470 | |
| DAPI | Roche Life Science | 10236276001 | |
| 3D支架制备 | 魔芋葡甘聚糖 | -- | -- |
| 海藻酸钠 | -- | -- | |
| 氯化钙 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime | C2015M |
| 流式细胞分析 | BD FACSVerse流式细胞仪 | BD | -- |
| 共聚焦成像 | Nikon A1 HD25共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| 冷冻切片 | Sakura Tissue-Tek® O.C.T.包埋剂 | Sakura | 4853 |
| 冷冻切片机 | SLEE | MEV | |
| H&E染色 | 伊红 | Sigma-Aldrich | HT110116 |
| 扫描电镜 | 日立TM-4000 plus扫描电子显微镜 | HITACHI | -- |
| 氨基酸分析 | 氨基酸分析仪 | Hitachi | LA8080 |
| 脂肪酸分析 | TG-5MS毛细管柱 | -- | -- |
| GC-MS分析 | Agilent 7890B-7000C气相色谱-质谱联用仪 | Agilent Technologies Inc. | -- |
| 固相微萃取纤维头（50/30 μm PDMS/CAR/DVB，2 cm） | Supelco Analytical | -- | |
| DB-5MS毛细管柱 | -- | -- | |
| 质构分析 | TA.XTplus质构仪 | Stable Micro Systems Ltd | -- |
| FAPs分离 | II型胶原酶 | Coolaber | CC3791G |
| 红细胞裂解液 | Solarbio | R1010 | |
| 细胞培养 | 明胶 | Stem Cell Technologies | 07903 |
| 共聚焦成像 | HBSS缓冲液 | Beyotime | C0219 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| pgEpiSCs向脂肪细胞分化 | 各阶段培养基配方（ADM I-V）、处理时间、起始接种密度2×10^5细胞/孔、罗格列酮浓度1 μM、IBMX浓度500 μM 阅读提示：Methods中'Adipogenic differentiation of pgEpiSCs by serum-free induction'小节及Supplementary Tables 1, 2 |
| pgEpiSCs向血管细胞分化 | VDM I-III培养基配方、处理时间、Tube formation实验细胞密度1×10^4/孔、Matrigel孵育时间4-6小时、DiI-Ac-LDL浓度20 μg/mL 阅读提示：Methods中'Vascular cells differentiation of pgEpiSCs by serum-free induction'、'In vitro tube formation assay'和'Uptake of Dil-Ac-LDL'小节 |
| 三维悬浮球体形成 | 细胞接种密度5.0×10^5/mL、旋转速度70 rpm、培养皿类型为非粘附培养皿、培养基更换时间点 阅读提示：Methods中'Spheroids formation and cultivation'及各球体培养小节 |
| 三谱系共培养多组织球体 | pgMPCs:pgAPCs:pgVPCs混合比例（2:2:1、1:1:1、1:1:2）、接种密度5.0×10^5/mL、MAVDM I-III培养基更换时间（5天、9天、16天） 阅读提示：Methods中'Culture of muscle-adipose-vascular spheroids'小节 |
| 培养肉营养与质构分析 | 氨基酸分析水解条件（110°C，22-24小时）、脂肪酸甲酯化条件（85°C水浴1小时）、质构分析参数（压缩50%、间隔5秒、2次循环）、香肠烹饪条件（82°C，45分钟） 阅读提示：Methods中'Amino acid composition analysis'、'Fatty acid composition analysis'、'Texture profile analysis'和'The production of cultured and farmed pork sausage'小节 |