多组学揭示IVDD乳酸化图谱
揭示IVDD中蛋白乳酸化图谱及氧化损伤与乳酸化的关联
对轻度和重度IVDD患者NP组织进行scRNA-seq和代谢组学分析，对PIDD大鼠和对照大鼠NP组织进行全蛋白乳酸化蛋白质组学分析，检测乳酸含量和pan-Kla水平。
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SOD1乳酸化通过构象变化损害其酶活性从而加重椎间盘退变
SOD1 lactylation impair its enzymatic activity by conformational change to aggravate intervertebral disc degeneration.
实验完整度
高含体外NPC、多种大鼠IVDD模型、患者样本、多组学、分子动力学模拟及功能与机制验证
主要模型
人髓核组织及原代髓核细胞 大鼠原代髓核细胞 雄性SD大鼠尾椎IVDD模型（PIDD、LAIDD、AIDD） SOD1K123R突变雄性大鼠
重点核对
PIDD模型：21G针头刺入尾椎5-6椎间盘深度5mm，旋转360度并保持30秒 LAIDD模型：注射2μL乳酸钠（2、6或10 mM）至尾椎5-6椎间盘 ZL-01治疗：损伤后注射2μL ZL-01（1、5、10或20 mM）至椎间盘 C-EVsZ治疗：注射5 μM C-EVsZ至椎间盘 体外乳酸处理：NPCs用不同浓度乳酸钠处理7天，每3天换液
摘要
乳酸积累是椎间盘退变（IVDD）的标志和促进因素，而乳酸积累引起的蛋白乳酸化在IVDD中的作用尚不清楚。通过代谢组学、单细胞RNA测序分析和乳酸化蛋白质组学，我们揭示了IVDD中的乳酸化修饰图谱，并鉴定出超氧化物歧化酶1（SOD1）在赖氨酸123位点的乳酸化（SOD1K123la）对IVDD加重至关重要。利用体外定点突变、体内生成SOD1K123R突变雄性大鼠以及计算机分子动力学模拟，我们发现SOD1K123la改变SOD1构象并损害其酶活性，诱导氧化损伤，并激活髓核细胞（NPCs）中的p53通路。值得注意的是，我们鉴定出小分子ZL-01可抑制SOD1K123la。通过II型胶原靶向肽修饰的细胞外囊泡将ZL-01靶向递送至NPCs，可减轻雄性大鼠的IVDD。总之，这些发现阐明了SOD1K123la促进IVDD加重的机制，并为IVDD提供了一种有前景的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 乳酸积累导致的蛋白乳酸化在椎间盘退变中的作用及机制尚不清楚，本研究旨在探索乳酸化在IVDD中的作用和机制。
- 核心机制
- SOD1K123la通过改变SOD1构象损害其酶活性，诱导氧化损伤并激活p53通路，从而加重IVDD；ZL-01可抑制SOD1K123la。
- 主要证据
- 通过代谢组学、scRNA-seq和乳酸化蛋白质组学发现SOD1K123la升高；体外K123R突变和体内SOD1K123R大鼠证实其减轻氧化损伤和IVDD；分子动力学模拟显示构象改变；ZL-01及C-EVsZ递送减轻大鼠IVDD。
- 研究意义
- 阐明了SOD1K123la促进IVDD加重的机制，并提供了一种有前景的IVDD治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
乳酸注射诱导大鼠椎间盘退变
验证乳酸积累是否促进IVDD和氧化损伤
建立LAIDD大鼠模型，通过MRI、组织学染色、DHE、流式细胞术和免疫荧光评估退变程度和氧化损伤。
体外乳酸处理NPCs
验证乳酸对NPCs氧化损伤和乳酸化的直接影响
用不同浓度乳酸钠处理原代大鼠NPCs，检测ROS、O2-、γ-H2AX、β-gal和pan-Kla水平。
SOD1K123la功能验证
验证SOD1K123la对SOD1酶活性和氧化损伤的影响
通过shRNA敲低内源性SOD1，过表达SOD1WT、SOD1K10R或SOD1K123R，在乳酸处理的NPCs中检测SOD1活性、ROS、DNA损伤和衰老。
SOD1K123R突变大鼠体内验证
在体内验证SOD1K123la对IVDD的作用
通过CRISPR-Cas9生成SOD1K123R雄性大鼠，构建PIDD模型，评估退变程度、SOD1K123la水平、p53通路和氧化损伤。
分子动力学模拟
阐明SOD1K123la改变SOD1构象的分子基础
对SOD1WT和SOD1K123la与O2-进行100 ns分子动力学模拟，分析RMSD、RG、SASA、RMSF、结合能和氢键网络。
ZL-01虚拟筛选与验证
筛选并验证SOD1K123la抑制剂
对160万化合物进行虚拟筛选，获得ZL-01，通过MST、DHE、流式细胞术和Western blot验证其结合和抑制效果。
C-EVsZ靶向递送治疗IVDD
评估NPC靶向递送ZL-01对IVDD的治疗效果
构建CTP修饰的细胞外囊泡负载ZL-01（C-EVsZ），注射至PIDD大鼠椎间盘，评估药物保留、退变程度和氧化损伤。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | II型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C2-BIOC |
| DMEM/F12培养基 | BI | -- | |
| 胎牛血清 | VivaCell | C04001500 | |
| 青霉素/链霉素 | Beyotime | C0222 | |
| 乳酸化蛋白质组学 | 抗L-乳酸化赖氨酸抗体偶联琼脂糖珠 | PTM Bio | PTM-1404 |
| 免疫荧光 | 抗γ-H2AX抗体 | ABclonal | AP0687 |
| 抗SOD1抗体 | Thermo Fisher | MA1-105 | |
| 抗泛乳酸化抗体 | PTM BIO | PTM-1401RM | |
| 抗SOD1K123la抗体 | PTM BIO | customized | |
| 活性氧检测 | 二氢乙锭 | MCE | HY-D0079 |
| 总ROS检测试剂盒 | Invitrogen | 88-5930-74 | |
| 乳酸定量 | L-乳酸检测试剂盒 | Abcam | ab65331 |
| MDA检测 | MDA检测试剂盒 | Beyotime | S0131M |
| T-AOC检测 | 总抗氧化能力检测试剂盒 | Beyotime | S0121 |
| SOD1活性检测 | 超氧化物歧化酶检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K022-M |
| Western blot | 抗P21抗体 | Abcam | ab109199 |
| 抗GADD45α抗体 | Abcam | ab54210 | |
| 抗SOD1抗体 | Abcam | ab13498 | |
| 抗泛乙酰化抗体 | PTM | PTM-101 | |
| 抗泛琥珀酰化抗体 | PTM | PTM-419 | |
| 抗β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| β-gal染色 | β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Beyotime | C0602 |
| 组织学染色 | SO & FG染色试剂盒 | Solarbio | G1371 |
| HE染色试剂盒 | Solarbio | G1120 | |
| RT-qPCR | PrimeScript逆转录试剂盒 | Takara | RR047A |
| Premix Ex Taq II试剂盒 | Takara | RR390A | |
| CCK-8 | CCK-8试剂 | Beyotime | C0038 |
| 细胞外囊泡提取 | 总外泌体分离试剂 | Invitrogen | 4478359 |
| MST | MST荧光染料 | NanoTemper | MO-L011 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PIDD模型构建 | 穿刺针规格21G、深度5mm、旋转360度并保持30秒、穿刺节段尾椎5-6 阅读提示：Methods中Experimental animal models小节 |
| LAIDD模型构建 | 注射乳酸钠浓度（2、6或10 mM）、体积2μL、注射节段尾椎5-6、注射后4周评估 阅读提示：Methods中Experimental animal models小节及Fig. 2A |
| SOD1K123R大鼠构建 | CRISPR-Cas9方法、gRNA序列、供体寡核苷酸、突变AAA至AGG 阅读提示：Methods中Generation of SOD1K123R rats小节 |
| 体外乳酸处理NPCs | 乳酸钠浓度、处理时间7天、每3天换液 阅读提示：Methods中Primary NPC isolation and lactate treatment小节 |
| ZL-01治疗 | ZL-01剂量（1、5、10或20 mM）、体积2μL、每周注射一次、注射后4周评估 阅读提示：Methods中Experimental animal models小节及Fig. S17 |
| C-EVsZ制备与治疗 | ZL-01与C-EVs比例1:6、超声循环条件、注射剂量5μM、注射后4周评估 阅读提示：Methods中Isolation and characterization of EVs, C-EVs, and C-EVsZ小节及Fig. 7A |
| 分子动力学模拟 | SOD1结构PDB ID 1PU0、力场Amber14SB、水模型TIP3P、模拟时间100ns、温度300K、压力1bar 阅读提示：Methods中Molecular dynamics simulations小节 |
| 虚拟筛选 | 化合物库规模160万、对接软件Schrödinger Maestro、筛选流程（HTVS、SP、XP） 阅读提示：Methods中High-throughput virtual screening小节 |