降解剂设计与合成
基于ST148设计靶向DENV衣壳蛋白的异双功能降解剂。
以ST148苯环对位为连接位点，通过Sonogashira偶联和酰胺缩合连接CRL4CRBN或CRL2VHL的E3连接酶配体，合成系列候选降解剂。
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登革病毒衣壳蛋白降解剂表现出与衣壳抑制剂不同的药理学特征
Degraders of the dengue virus capsid protein exhibit differentiated pharmacology relative to capsid inhibitors.
实验完整度
高包含体外细胞模型、基因敲除细胞、病毒学功能实验、机制验证（三元复合物、泛素化）及电镜等多层级证据。
主要模型
Huh7.5细胞（DENV2感染） Huh7.5-CRBN-/-敲除细胞 HEK293细胞（C-nLuc转染） MOLT4细胞（蛋白质组学）
重点核对
RPG-01-132浓度依赖性降解DENV2 C，DC50为2.4 µM，Dmax为84% RPG-01-132抗病毒EC50为0.47 ± 0.1 µM 降解活性在Huh7.5-CRBN-/-细胞中丧失 MLN4924（neddylation抑制剂）部分逆转降解和抗病毒活性 RPG-01-132对ST148耐药突变体C-S34L的EC50为0.58 ± 0.28 µM，DC50为1.85 µM
摘要
由于病毒基因组尺寸有限，大多数病毒蛋白具有多功能性；然而大多数直接作用抗病毒药物被设计为单功能抑制剂。登革病毒（DENV）衣壳蛋白既是新病毒粒子的组成单元，又与多种宿主因子相互作用以重塑细胞环境。以已建立的衣壳抑制剂ST148作为靶向配体，我们开发了一种DENV衣壳降解剂RPG-01-132，其对四种DENV血清型和ST148耐药突变病毒表现出更广谱的活性。通过多种方法，我们证明RPG-01-132的亚微摩尔抗病毒活性是由于CRL4CRBN依赖的衣壳降解，且该机制破坏了生产性感染所需的衣壳相关通路，包括感染性病毒输出和衣壳介导的干扰素反应拮抗。该药理学特征与ST148显著不同，后者干扰新病毒粒子的组装，但未证明对衣壳的非结构功能有影响。这些发现表明，靶向蛋白降解能够实现传统抗病毒抑制剂未观察到的抗病毒药理学，并且对降低抑制剂效力的点突变具有韧性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否将登革病毒衣壳蛋白作为靶向蛋白降解的靶点，并产生与传统抑制剂不同的抗病毒药理学？
- 核心机制
- RPG-01-132通过CRL4CRBN依赖的靶向蛋白降解降低DENV衣壳蛋白水平，进而破坏衣壳相关通路，包括病毒粒子组装和衣壳介导的干扰素反应拮抗。
- 主要证据
- 在DENV2感染的Huh7.5细胞中，RPG-01-132浓度依赖性降解C蛋白（DC50 2.4 µM，Dmax 84%），抗病毒EC50为0.47 µM；降解和抗病毒活性在CRBN敲除细胞中丧失，并被MLN4924部分逆转；NanoBRET证实三元复合物形成和C泛素化；电镜显示病毒粒子组装受阻；RPG-01-132可挽救IFN-β启动子活性。
- 研究意义
- 证明靶向蛋白降解可针对多功能病毒蛋白实现传统抑制剂未观察到的抗病毒药理学，并对降低抑制剂效力的点突变具有韧性，为开发靶向DENV衣壳的TPD类直接作用抗病毒药物提供了概念验证和技术基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
初步筛选降解活性
评估候选降解剂对DENV2衣壳蛋白丰度的影响。
Huh7.5细胞感染DENV2 NGC（MOI 0.5）1小时后，加入候选降解剂（5 µM和10 µM）处理24小时，Western blot检测细胞内C蛋白丰度，并设置游离E3配体竞争组。
验证CRL4CRBN依赖性降解机制
确认RPG-01-132通过CRL4CRBN依赖的靶向蛋白降解机制降低C蛋白。
在野生型Huh7.5和Huh7.5-CRBN-/-细胞中感染DENV2 NGC（MOI 0.5），用RPG-01-132系列浓度处理24小时，Western blot检测C蛋白；并使用neddylation抑制剂MLN4924、阴性对照化合物RPG-01-132-BUMP进行验证。
检测三元复合物形成和C泛素化
验证RPG-01-132促进CRBN-C三元复合物形成及C泛素化。
HEK293细胞共转染C-nLuc和HaloTag-CRBN或HaloTag-泛素，加入RPG-01-132后通过NanoBRET检测三元复合物和泛素化；并用蛋白酶体抑制剂MG-132验证。
评估抗病毒活性
测定RPG-01-132对感染性病毒产量的抑制效果。
收集上述处理后的培养上清，通过病毒空斑试验定量感染性子代病毒滴度，计算EC50。
排除脱靶GSPT1降解的贡献
确认RPG-01-132的抗病毒活性不依赖于GSPT1降解。
用5 µM RPG-01-132或RPG-01-139处理MOLT4细胞8小时，蛋白质组学分析底物谱；比较RPG-01-132与CC-90009、SJ6986的GSPT1 DC50和抗病毒EC50。
电镜观察病毒粒子组装
比较ST148和RPG-01-132对DENV粒子组装的影响。
Huh7.5细胞感染DENV2 NGC（MOI 20）1小时后，用10 µM ST148或30 µM RPG-01-132处理24小时，固定、切片、负染后透射电镜观察。
检测对IFN-β启动子拮抗功能的影响
验证RPG-01-132能否逆转C介导的IFN-β启动子抑制。
HEK293细胞转染pIFN-β-Luc报告质粒，24小时后共转染poly(I:C)和C-nLuc质粒，同时加入ST148、RPG-01-132或RPG-01-132-BUMP（0.156、0.312、0.625 µM），24小时后检测荧光素酶活性。
评估对耐药突变体和不同血清型的活性
比较RPG-01-132与ST148对四种DENV血清型及ST148耐药突变体的活性。
在Huh7.5细胞中感染DENV1 WP74、DENV2 NGC、DENV2 16681、DENV3 THD3、DENV4 TVP360或DENV2 16681 C-S34L（MOI 0.5），用ST148或RPG-01-132处理24小时，检测病毒滴度和C蛋白降解。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Corning | 10-013-CV |
| 最小必需培养基-α | Corning | 10-022-CV | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| Western blot | 放射免疫沉淀试验缓冲液 | Thermo Scientific Chemicals | J62524AE |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Apexbio Technology LLC | K10191 | |
| Mini-PROTEAN TGX预制胶 | Bio-Rad Laboratories | 4561106 | |
| Trans-Blot Turbo RTA PVDF转印试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | 1704272 | |
| Trans-Blot Turbo转印系统 | Bio-Rad Laboratories | 17001917 | |
| 牛血清白蛋白 | Fisher Bioreagents | BP9703100 | |
| Pierce SuperSignal West Pico Plus化学发光底物 | Thermo Scientific | 34580 | |
| ImageQuant 800 CCD成像仪 | Cytiva | -- | |
| 抗登革病毒2型衣壳蛋白抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-35908 | |
| 抗GAPDH抗体 | GeneTex | GTX28245 | |
| 抗eRF3/GSPT抗体 | Abcam | ab126090 | |
| 抗CRBN抗体 | Cell Signaling Technology | 71810 | |
| 抗登革病毒NS4B抗体 | GeneTex | GTX124250 | |
| 抗登革病毒NS5抗体 | GeneTex | GTX629446 | |
| HRP标记山羊抗小鼠IgG | Bio-Rad Laboratories | 1706516 | |
| HRP标记山羊抗兔IgG | Bio-Rad Laboratories | 1706515 | |
| NanoBRET | HaloTag-CRBN质粒 | Promega | -- |
| HaloTag-泛素质粒 | Promega | -- | |
| 转染 | XtremeGeneHP DNA转染试剂 | Roche | 06366244001 |
| NanoBRET | HaloTag NanoBRET 618配体 | Promega | -- |
| NanoBRET Nano-Glo底物 | Promega | -- | |
| CLARIOstar酶标仪 | BMG Labtech | -- | |
| 白色384孔板 | Corning | 3570 | |
| CRBN engagement assay | dBET6 | MedChemExpress | HY-112588 |
| Nano-Glo HiBiT裂解检测系统 | Promega | N3040 | |
| D300e数字分液器 | Tecan | -- | |
| 病毒滴度测定 | HyClone Earle's 1×平衡盐溶液 | Cytiva | SH30029.02 |
| RT-qPCR | iScript™ RT-qPCR样品制备试剂 | Bio-Rad | 1708898 |
| iScript™ cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | 1708890 | |
| iQ™ SYBR Green预混液 | Bio-Rad | 1708880 | |
| CFX96实时PCR系统 | Bio-Rad | -- | |
| 亚基因组复制子实验 | Hoechst 33342 | ApexBio | A3472 |
| FluoroBrite™ DMEM | Gibco | A1896701 | |
| 黑色透明底384孔板 | Corning | 3764 | |
| IFN-β启动子活性实验 | 聚肌胞苷酸 | InvivoGen | tlrl-pic |
| ONE-Glo EX荧光素酶检测试剂 | Promega | E8120 | |
| NanoDLR Stop and Glo试剂 | Promega | N1610 | |
| 白色96孔板 | Corning | 3917 | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测 | Promega | G7572 |
| 慢病毒包装 | TransIT-LT1转染试剂 | Mirus Bio | MIR2304 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 降解剂初步筛选 | DENV2 NGC感染MOI 0.5；化合物浓度5 µM和10 µM；处理时间24小时；竞争剂lenalidomide 10 µM或VH032 5 µM。 阅读提示：Methods病毒学实验部分及图2图注。 |
| CRBN依赖性降解验证 | Huh7.5与Huh7.5-CRBN-/-细胞对比；RPG-01-132浓度系列；处理24小时；MLN4924 1.25 µM。 阅读提示：图3及图注，Methods中Western blot和抗病毒实验部分。 |
| 三元复合物和泛素化检测 | HEK293细胞共转染比例1:10或1:100；RPG-01-132处理4小时（三元复合物）或24小时（泛素化）；MG-132 10 µM。 阅读提示：Methods中NanoBRET实验部分，补充图8和9。 |
| 抗病毒活性测定 | DENV2 NGC MOI 0.5；化合物浓度系列；处理24小时；空斑试验使用BHK21细胞，孵育4-5天。 阅读提示：Methods中Antiviral assay部分，图4图注。 |
| 电镜观察 | DENV2 NGC MOI 20；ST148 10 µM或RPG-01-132 30 µM；处理24小时；每个条件筛选两个网格，展示三个代表性图像。 阅读提示：图5a图注，Methods中Electron microscopy部分。 |
| IFN-β启动子实验 | HEK293细胞；pIFN-β-Luc 6.3 ng/孔；poly(I:C) 7.8 ng/孔；C-nLuc 25 ng/孔；化合物浓度0.156、0.312、0.625 µM；转染后24小时检测。 阅读提示：图5b、c图注，Methods中IFN-β promoter activity assay部分。 |
| 耐药突变体和血清型活性 | DENV1 WP74、DENV2 NGC、DENV2 16681、DENV3 THD3、DENV4 TVP360、DENV2 16681 C-S34L；MOI 0.5；ST148和RPG-01-132浓度10 µM（血清型）或系列浓度（突变体）；处理24小时。 阅读提示：图6图注，Methods中Antiviral assay部分。 |