回顾性队列分析脐血输注时机与aGVHD
验证清晨脐血输注是否降低aGVHD严重程度并改善生存
纳入2014年1月至2020年12月单份无关脐血移植的急性白血病患者，按中位输注时间9:40 am分为早输注组和晚输注组，比较aGVHD累积发生率、cGVHD、TRM、OS、DFS、GRFS及复发，并进行多因素分析
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可溶性CD26的昼夜节律波动决定脐血移植时机对急性移植物抗宿主病的影响
Circadian fluctuation of soluble CD26 dictates the impact of the timing of cord blood transplantation on acute graft-versus-host disease.
实验完整度
高包含回顾性临床队列、患者血清细胞因子检测、小鼠异基因及异种aGVHD模型、体外PBMC/MLR功能验证及RNA测序机制分析
主要模型
无关脐血移植急性白血病患者回顾性队列（n=434） MHC不匹配BALB/c→C57BL/6J小鼠aGVHD模型 NSG小鼠异种aGVHD模型（输注人脐血单个核细胞） 健康供者PBMC与CD3+ T细胞体外培养
重点核对
脐血输注时间分组：以9:40 am为界，早输注组（≤9:40 am，n=219）与晚输注组（>9:40 am，n=215） 患者血清采集时间点：7:00 am ±15 min（n=10或19）、11:30 am ±15 min（n=10或19）、4:00 pm ±15 min（n=29） 小鼠移植时间点：ZT5与ZT14（及ZT22），MHC不匹配模型照射11 Gy，输注1×10^7骨髓细胞+6×10^7脾细胞 西格列汀给药：30 mg/kg腹腔注射，ZT5小鼠移植前给3剂（异种模型）或2剂（MHC不匹配模型），对照为等体积PBS 体外处理浓度：重组人CD26/DPPIV 1000 ng/mL，西格列汀200 μg/mL，PHA-L 1.25 μg/mL
摘要
异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是许多恶性和非恶性血液系统疾病的重要治疗手段。我们近期研究表明，在新鲜移植物allo-HSCT中，清晨输注干细胞可显著降低急性移植物抗宿主病（aGVHD）的发生率和严重程度。然而，输注时机对使用冷冻保存移植物（如无关脐血，UCB）的allo-HSCT中aGVHD的影响尚不清楚。本研究表明，清晨脐血输注可显著降低aGVHD严重程度并改善生存。我们进一步发现，细胞因子的昼夜变化、特别是可溶性CD26（sCD26），与aGVHD严重程度相关。使用西格列汀（Sitagliptin）抑制sCD26酶活性可显著减轻晚期输注雌性小鼠的aGVHD并改善生存。我们的研究表明，将UCB移植安排在清晨可能是预防aGVHD的简单有效策略，而抑制sCD26可能是晚期输注的有前景的治疗方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在采用冷冻保存无关脐血移植时，输注时机是否影响aGVHD的发生与严重程度，其机制是否与受者移植前免疫环境的昼夜节律相关。
- 核心机制
- 受者移植前血清sCD26/DPPIV水平呈昼夜节律升高，其水平与aGVHD严重程度正相关；sCD26/DPPIV通过促进抗原提呈细胞CD80/CD86表达及T细胞活化、增殖和分化加重aGVHD，而西格列汀通过抑制DPPIV酶活性减轻T细胞活化。
- 主要证据
- 434例单份脐血移植回顾性队列显示早输注组III-IV级aGVHD累积发生率显著低于晚输注组且生存改善；患者血清中sCD26是7:00 am与11:30 am间唯一显著差异的细胞因子；异种及MHC不匹配小鼠模型中移植前西格列汀给药减轻aGVHD并改善生存；体外PBMC和MLR实验显示sCD26/DPPIV促进而西格列汀抑制T细胞增殖、活化与IFNγ产生。
- 研究意义
- 将无关脐血移植安排在清晨可能是预防aGVHD的简单有效策略；对于无法优化移植时机的患者，抑制sCD26/DPPIV（如西格列汀）可能是有前景的aGVHD预防治疗方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测受者移植前血清细胞因子昼夜变化
寻找与输注时机相关的移植前免疫环境昼夜差异因子
采集清髓性预处理后、脐血输注前的受者血清，检测49种细胞因子和趋化因子，并分析sCD26/DPPIV与炎症因子的相关性
验证上皮细胞CD26/DPPIV的昼夜节律
确定循环sCD26/DPPIV昼夜波动的细胞来源
对健康人肠道活检样本进行CD26/DPPIV免疫荧光染色，培养原代小鼠肠上皮细胞并检测DPP4 mRNA与上清sCD26/DPPIV浓度，分析公共GEO数据集中WT与Bmal1△EC小鼠表皮细胞DPP4表达
小鼠aGVHD模型中验证西格列汀的保护作用
验证抑制DPPIV活性是否减轻aGVHD并改善生存
在NSG异种aGVHD模型和MHC不匹配aGVHD模型中，于ZT5移植前给予西格列汀，评估aGVHD评分、生存、体重、组织病理及CD4+/CD8+ T细胞浸润
体外验证sCD26/DPPIV与西格列汀对T细胞的作用
阐明sCD26/DPPIV和西格列汀对T细胞活化、增殖和分化的直接影响及抗原提呈细胞的中介作用
健康供者PBMC或CD3+ T细胞在PHA-L刺激下与重组CD26/DPPIV或西格列汀共培养，进行RNA测序和流式检测；并进行MLR实验
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | C22400500BT |
| 胎牛血清 | Biological Industries | C04001-500 | |
| 红细胞裂解 | 红细胞裂解液 | BD Pharm Lyse | 555899 |
| PBMC分离 | Ficol-Paque Plus密度梯度分离液 | Solarbio | P4350 |
| CD3+ T细胞分离 | CD3磁珠 | Miltenyi Biotech | 130-050-101 |
| CD34+细胞分离 | CD34磁珠 | Miltenyi Biotech | 130-046-702 |
| CD34+细胞培养 | StemSpan SFEM II培养基 | STEMCELL Technologies | 09655 |
| 集落形成实验 | MethoCult™ H4435富集培养基 | STEMCELL Technologies | 04435 |
| T细胞刺激 | 植物血凝素-L | eBioscience | 00-4977-93 |
| 体外处理 | 重组人CD26/DPPIV蛋白 | R&D Systems | 11244-SE |
| 体外处理及动物给药 | 磷酸西格列汀一水合物 | Selleck | S4002 |
| MLR增殖标记 | CellTrace™ Violet细胞增殖染料 | Invitrogen | C34557 |
| RNA提取 | TRIzol试剂盒 | Invitrogen | 15596026CN |
| RNA文库构建 | NEBNext Ultra RNA文库构建试剂盒 | New England Biolabs | #7530 |
| RNA文库纯化 | AMPure XP磁珠 | -- | -- |
| 流式分析 | 可固定活性染料eFluor 506 | eBioscience | -- |
| Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | eBioscience | 00-5523-00 | |
| FACSAria II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| RT-qPCR | SuperScript™ III第一链合成系统 | Invitrogen | 18080-051 |
| 细胞因子检测 | 小鼠炎症因子检测试剂盒 | Biolegend | 740150 |
| Bio-Plex Pro人细胞因子筛选试剂盒 | Bio-Rad | 12007283 | |
| DPPIV酶活性检测 | DPPIV-Glo™蛋白酶检测试剂盒 | Promega | G8350 |
| sCD26/DPPIV浓度检测 | 酶联免疫吸附检测试剂盒 | R&D Systems | DC260B |
| 免疫组化 | 抗人CD4抗体 | Abcam | ab133616 |
| 抗人CD8抗体 | ZSGB-BIO | ZA-0508 | |
| 抗小鼠CD4抗体 | CST | 25229S | |
| 抗小鼠CD8抗体 | ABclonal | A23305PM | |
| 免疫荧光 | 抗CD26/DPPIV抗体 | Abcam | ab215711 |
| 抗EpCAM抗体 | Abcam | ab213500 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 回顾性队列输注时间分组与aGVHD评估 | 输注时间分界值（9:40 am）、早/晚输注组样本量（n=219/215）、aGVHD分级标准（MAGIC标准）、GVHD预防方案（CsA+MMF） 阅读提示：Methods中Patient characteristics and cohort formation及Definitions小节，Fig. 1图注 |
| 患者血清sCD26/DPPIV及细胞因子检测 | 采血时间点（7:00 am、11:30 am、4:00 pm ±15 min）、各时间点样本量、样品保存条件（4°C、4 h内处理）、细胞因子检测 panel 阅读提示：Methods中Measurement of cytokine levels小节，Fig. 2图注 |
| 小鼠aGVHD模型建立与西格列汀给药 | 小鼠品系与周龄、照射剂量（NSG 3 Gy；C57BL/6J 11 Gy）、输注细胞数量与来源、移植时间点（ZT5/ZT14/ZT22）、西格列汀剂量（30 mg/kg）与给药剂数及途径 阅读提示：Methods中aGVHD mouse models及In vivo inhibitor treatment小节，Fig. 4a图注，Supplementary Fig. 4 |
| 体外PBMC/MLR实验 | 细胞浓度、PHA-L浓度（1.25 μg/mL）、重组CD26/DPPIV浓度（1000 ng/mL）、西格列汀浓度（200 μg/mL）、共培养时间（72 h/96 h）、MLR responder-to-stimulator比例（2:1） 阅读提示：Methods中Cell culture assay及Mixed Lymphocyte Reaction小节，Fig. 5a和Fig. 6a图注 |