CC-CBE系统的构建与体外表征
验证卷曲螺旋异二聚体能否介导分裂CBE的重组并保持或提高编辑效率。
将CBE分裂为APOBEC3和nCas9-UGI两部分，分别融合P3/P4或N5/N6卷曲螺旋肽，在HEK293T细胞中转染并分选双阳性细胞，比较C-to-T编辑效率和indel率。
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卷曲螺旋异二聚体介导的分裂型碱基编辑系统实现灵活稳健的核苷酸替换
Coiled-coil heterodimer-mediated split base editing systems enable flexible and robust nucleotide substitutions.
实验完整度
高包含HEK293T、MEF、PFF、N2a细胞系及小鼠模型，进行编辑效率、脱靶、WGS和体内双AAV递送验证。
主要模型
HEK293T细胞 猪胎儿成纤维细胞（PFF） 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） ∆Ex51小鼠及C57BL/6J小鼠
重点核对
HEK293T细胞中转染后72小时分选双阳性细胞，4个独立生物学重复 PFF和MEF细胞电转染后72小时收集细胞，3个独立生物学重复 小鼠体内注射AAV8或AAV9，剂量为2.5×10^11或5×10^11病毒基因组，注射后2周或6周或7周检测 脱靶分析使用COSMID预测和R-loop实验，全基因组测序30×覆盖度 统计采用双尾Student's t检验，误差线表示均值±标准差
摘要
碱基编辑器（BEs）能够实现精确的碱基替换，但其尺寸超过腺相关病毒（AAV）的包装容量，阻碍了体内应用。在此，我们设计了一种分裂型BE系统，通过卷曲螺旋异二聚体将脱氨酶招募到Cas9切口酶上，产生了多种卷曲螺旋异二聚体介导的碱基编辑器（CC-BEs），包括胞苷碱基编辑器（CC-CBE）、腺嘌呤碱基编辑器（CC-ABE）及其衍生物。我们发现CC-BEs在多种细胞类型和编辑范围内保持甚至提高了原始未分裂BEs的编辑效率，CC-CBE在人永生化细胞和原代体细胞中分别实现最高9.6倍和12.4倍的增强。利用CC-ABE，我们验证了体内编辑效率，并通过双AAV载体在小鼠Pcsk9和Dmd基因中成功实现了A-to-G转换。总之，我们开发了一种简单且通用的策略，可在不损害体内碱基替换编辑效率的情况下解决BEs尺寸大带来的挑战。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何解决碱基编辑器尺寸过大难以包装入AAV的问题，同时保持或提高编辑效率？
- 核心机制
- 通过卷曲螺旋异二聚体（P3-P4或N5-N6）将脱氨酶招募到Cas9切口酶上，重组形成有功能的碱基编辑器，不依赖分裂位点选择且不留下足迹。
- 主要证据
- 在HEK293T、PFF、MEF和N2a细胞中比较CC-BE与未分裂BE的编辑效率；双AAV递送CC-ABE在小鼠肝脏Pcsk9基因实现高达79.0%的A-to-G编辑，在∆Ex51小鼠肌肉中恢复dystrophin表达；全基因组测序显示脱靶效应与未分裂BE相当。
- 研究意义
- 提供了一种简单、通用、高效的碱基编辑策略，克服AAV包装限制，促进碱基编辑器在体内的治疗应用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CC-ABE系统的构建与体外表征
验证卷曲螺旋异二聚体能否介导分裂ABE的重组并保持编辑效率。
将ABE8e分裂为TadA8e和nCas9两部分，分别融合P3/P4或N5/N6，在HEK293T细胞中比较A-to-G编辑效率和indel率。
CC-BE系统对其他碱基编辑器的拓展
评估卷曲螺旋异二聚体是否适用于TadCBE、ABE9和AYBE等其他碱基编辑器。
构建CC-TadCBE、CC-ABE9和CC-AYBE，在HEK293T细胞中比较编辑效率和纯度。
NG-CC-BE系统拓展靶向范围
验证CC-BE系统能否与SpCas9-NG变体兼容以识别NG PAM。
构建NG-CC-BE3和NG-CC-ABE8e，在HEK293T细胞中针对NG PAM位点比较编辑效率。
CC-BE在原代猪胎儿成纤维细胞中的验证
验证CC-BE在其他哺乳动物原代细胞中的编辑活性。
在PFF细胞中电转染CC-CBE和CC-ABE，72小时后收集细胞进行靶向深度测序。
CC-BE脱靶效应评估
评估CC-BE的sgRNA依赖性和非依赖性脱靶编辑。
使用COSMID预测脱靶位点进行深度测序，正交R-loop实验检测sgRNA非依赖性脱靶，全基因组测序分析SNV和indel。
CC-ABE在Fah突变MEF中的校正验证
验证CC-ABE能否校正致病点突变。
在携带Fah基因G-to-A突变的MEF细胞中电转染sABE-P3P4和sgRNA，深度测序检测A9-to-G转换效率。
双AAV递送CC-ABE体内编辑Pcsk9
验证CC-ABE通过双AAV在体内肝脏中的编辑效率和治疗效果。
将sABE-P3P4包装入AAV8，通过腹腔或静脉注射给予1周龄或4周龄小鼠，检测肝脏A6-to-G编辑效率及血清指标。
双AAV9递送NG-CC-ABE治疗DMD小鼠
验证CC-BE在非肝脏组织中的体内编辑并恢复dystrophin表达。
将NG-sABE8e-P3P4包装入AAV9，通过局部肌肉注射或腹腔注射给予5周龄∆Ex51雄性小鼠，7周后检测肌肉编辑效率和dystrophin表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 质粒构建 | pEASY-Uni无缝克隆与组装试剂盒 | TransGen Biotech | CU101-02 |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | -- | |
| GlutaMAX | Gibco | -- | |
| HEK293T细胞转染 | 聚乙烯亚胺 | Sigma | 408727 |
| PFF和MEF细胞电转染 | Neon转染系统 | Life Technology | -- |
| N2a细胞转染 | Lipo 8000TM | Beyotime | C0533 |
| 细胞分选 | MoFlo Astrios流式细胞分选仪 | -- | -- |
| 细胞裂解 | NP40 | -- | -- |
| PCR扩增 | 2×Hieff Canace® Plus PCR Master Mix（含染料） | YEASEN | 10154ES03 |
| PCR产物纯化 | HiPure凝胶DNA纯化迷你试剂盒 | Magen | D2111-03 |
| DNA定量 | Equalbit™ dsDNA HS检测试剂盒 | Vazyme | -- |
| 高通量测序 | Illumina HiSeq X测序平台 | Annoroad Gene Technology Corporation | -- |
| Western blot | 兔抗Cas9抗体 | HUABIO | ET1703-85 |
| β-肌动蛋白抗体 | Affinity | AF7018 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG抗体 | Servicebio | GB23303 | |
| Western blotting鲁米诺试剂 | Vazyme | E411-05 | |
| AAV注射 | 5%水合氯醛 | -- | -- |
| 肝脏基因组DNA提取 | TIANamp基因组DNA试剂盒 | TIANGEN | -- |
| RNA提取 | RNA快速提取液 | Servicebio | G3013 |
| RT-PCR | PrimeScriptTM逆转录试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | RRO47A |
| 免疫荧光染色 | 抗层粘连蛋白2α抗体[4H8-2] | abcam | ab11576 |
| 抗肌萎缩蛋白（PT0821R）PT®兔单克隆抗体 | Immunoway | YM8580 | |
| 抗大鼠IgG（H+L）二抗 | CST | 4418 | |
| 抗兔IgG（H+L）二抗 | CST | 4412 | |
| DAPI封片剂 | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | |
| 免疫荧光成像 | Zeiss LSM 800共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 血清生化分析 | 小鼠PCSK9快速检测ELISA试剂盒 | -- | QT-EM0153 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HEK293T细胞转染与分选 | 转染试剂PEI用量（3μg/孔）、质粒量（1μg/孔）、分选时间（转染后72小时）、双阳性细胞分选门控 阅读提示：Methods中Cell culture and transfection和FACS小节，Supplementary Fig. 1 |
| PFF和MEF细胞电转染 | 电转染参数（1350V，30ms，1脉冲）、质粒量（gRNA 1μg + BE 3μg或sBE 1.5μg+1.5μg）、收集时间（72小时） 阅读提示：Methods中Cell culture and transfection小节 |
| 小鼠体内AAV注射 | AAV血清型（AAV8或AAV9）、剂量（2.5×10^11或5×10^11病毒基因组）、注射途径（腹腔、静脉或局部肌肉）、注射时小鼠周龄、检测时间点 阅读提示：Methods中AAV production and injection小节，Fig. 6c和Fig. 7d |
| 脱靶分析 | COSMID预测参数、R-loop实验转染量（375ng BE、250ng SpCas9 sgRNA、375ng dSaCas9/sgRNA）、WGS覆盖度（30×） 阅读提示：Methods中Off-target analysis、R-loop assay和Whole genome sequencing data analysis小节 |
| 统计方法 | 双尾Student's t检验、误差线表示均值±标准差、独立生物学重复数（至少3次） 阅读提示：Methods中Statistics and reproducibility小节，各Figure legends |