建立KRAS突变结直肠癌类器官及耐药模型
获得可模拟KRAS突变CRC药物应答的体外模型。
从手术切除标本建立KRAS G12C突变PDO，并使用既往建立的KRAS G12A突变trametinib耐药PDO HCT24-8及其同源KRAS野生型PDO HCT24-14；通过外显子测序确认突变。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
核糖体生物合成作为KRAS突变结直肠癌的潜在治疗靶点
Ribosome biogenesis as a potential therapeutic target in KRAS mutant colorectal cancer.
实验完整度
高包含患者来源类器官、单细胞转录组、磷酸化蛋白质组、自发小鼠肠道肿瘤模型及功能与机制验证
主要模型
KRAS G12A突变结直肠癌PDO HCT24-8及同源KRAS野生型PDO HCT24-14 KRAS G12C突变结直肠癌PDO（HCT191-1T等四例） Apcflox/flox;KrasLSL-G12D/+;Lgr5-CreERT2/+小鼠肠道自发肿瘤模型
重点核对
trametinib处理浓度10 nM、处理时间24 h（单细胞表达谱）或6 h（免疫印迹） AMG510处理浓度100 nM、处理时间24 h（RNA-seq） CX-5461体内剂量0.1 mg/kg，trametinib 1 mg/kg，4-OHT诱导后13天开始每日一次连续5天给药 HCT24-8与HCT24-14同源PDO对trametinib敏感性差异（n=4孔） 药物联用采用恒定比例与非恒定比例Chou-Talalay法计算联合指数
摘要
针对KRAS信号通路的分子靶向治疗显著改善了患者预后，但在结直肠癌（CRC）中尚未达到足够的治疗效果。在此，我们证明一部分KRAS突变CRC细胞在KRAS信号抑制后转变为以核糖体生物合成增强为特征的细胞状态。丝裂原活化蛋白激酶激酶抑制剂trametinib和AMG510诱导出一种基因表达谱高度富集核糖体生物合成的细胞状态。我们发现这些细胞对RNA聚合酶I抑制敏感，并在肠道肿瘤自发小鼠模型和人患者来源类器官（PDO）中与trametinib表现出协同抗肿瘤效应。这些观察表明，KRAS抑制诱导的高核糖体生物合成对于维持该细胞状态不可或缺，并且是一个潜在的治疗靶点。总体而言，本研究揭示了KRAS抑制耐药耐受的新机制，从而有助于开发新的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- KRAS突变结直肠癌细胞在KRAS信号抑制后产生的耐药耐受细胞状态具有何种分子特征，以及该状态是否存在可靶向的脆弱性。
- 核心机制
- KRAS抑制（trametinib或AMG510）诱导KRAS突变CRC细胞进入以Myc依赖的核糖体生物合成增强、但整体蛋白合成降低为特征的类胚胎干细胞基态细胞状态；该高核糖体生物合成状态对RNA聚合酶I抑制敏感。
- 主要证据
- 单细胞转录组显示trametinib增加富集核糖体基因与Myc靶标的C1细胞群；免疫印迹证实核糖体蛋白PABP1、RPL13A、RPL23上调；fibrillarin升高而OPP掺入降低；CX-5461抑制EU掺入并与trametinib协同降低PDO活力；自发小鼠肠道肿瘤模型中联合治疗使肿瘤面积进一步降低。
- 研究意义
- 揭示了KRAS抑制耐药耐受的新机制，提示靶向核糖体生物合成与KRAS抑制剂联合是KRAS突变结直肠癌的潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞转录组解析trametinib诱导的细胞状态
明确KRAS/MEK抑制后CRC类器官细胞状态与基因表达特征的变化。
对trametinib处理与未处理的HCT24-8 PDO进行多重单细胞表达谱分析，聚类并注释细胞类型，进行GOCC、Hallmark和胚胎干细胞基态基因集富集分析。
验证核糖体生物合成与蛋白合成表型
验证trametinib诱导的核糖体生物合成增强及整体翻译降低。
免疫印迹检测核糖体蛋白水平；免疫荧光检测fibrillarin；OPP掺入检测整体蛋白合成；EdU掺入检测DNA复制。
磷酸化蛋白质组分析KRAS突变与trametinib应答
系统解析KRAS突变及trametinib处理后的磷酸化信号网络。
比较KRAS突变与野生型同源PDO，以及trametinib处理6、24、72 h后的磷酸化位点变化，进行IPA、GO、PTMsigDB富集分析。
评估CDK抑制剂与trametinib的协同效应
检验trametinib影响的CDK底物磷酸化是否与耐药相关。
在HCT24-8 PDO中测试七种CDK抑制剂与trametinib联用的效果，以Chou-Talalay联合指数评价协同作用，并对dinaciclib处理后的类器官进行转录组分析。
评估RNA聚合酶I抑制与trametinib的协同效应
明确核糖体生物合成抑制是否与trametinib协同。
使用CX-5461处理CRC PDO，检测EU掺入与rRNA水平，并以恒定和非恒定比例联合指数评价其与trametinib的协同作用。
体内验证联合抗肿瘤效果
在自发肠道肿瘤小鼠模型中验证trametinib与CX-5461的抗肿瘤作用及联合效果。
通过皮下注射4-OHT诱导Apcflox/flox;KrasLSL-G12D/+;Lgr5-CreERT2/+小鼠肠道肿瘤，给予trametinib、CX-5461或联合治疗，评估fibrillarin表达、肿瘤负荷、EdU掺入、正常肠组织和体重。
评估内在核糖体生物合成与AMG510敏感性的关系
探究核糖体生物合成在KRAS G12C突变CRC对AMG510应答中的作用。
建立四例KRAS G12C突变PDO，检测AMG510对活力的影响，进行单细胞转录组、EU掺入和fibrillarin免疫荧光分析，并评价CX-5461与AMG510的协同作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
转录组与单细胞分析
磷酸化蛋白质组分析
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 类器官培养 | 基质胶 | -- | -- |
| Advanced DMEM/F12培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| B27添加剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| GlutaMAX添加剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 胃泌素I | Sigma | -- | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Wako | -- | |
| 小鼠重组EGF | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 人重组R-spondin1 | R&D | -- | |
| 类器官传代消化 | TrypLE Express消化酶 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Y27632 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo 3D细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| Mithras LB 940发光检测仪 | Berthold Technologies | -- | |
| 药物处理 | 曲美替尼 | Sellec | -- |
| AMG510 | Sellec | -- | |
| CX-5461 | -- | -- | |
| 核酸提取 | QIAamp DNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| 核酸质量检测 | Qubit系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 外显子测序建库 | SureSelect人全外显子V6试剂盒 | Agilent | -- |
| 外显子测序 | Illumina HiSeq2500测序系统 | Illumina | -- |
| RNA提取 | RNeasy微型试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA质量检测 | 2100 Expert Bioanalyzer软件 | Agilent | -- |
| RNA-seq建库 | Illumina TruSeq链特异性mRNA LT样本制备试剂盒 | Illumina | -- |
| RNA-seq测序 | Illumina NovaSeq6000测序系统 | Illumina | -- |
| 单细胞RNA-seq | 10X Genomics 3’ CellPlex试剂盒 | 10X Genomics | PN-1000261 |
| Chromium Nex GEM单细胞3’试剂盒v.3.1 | 10X Genomics | -- | |
| Illumina NextSeq 550测序平台 | Illumina | -- | |
| 磷酸化蛋白质组 | TMT 11plex试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q Exactive Plus质谱仪 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 兔抗fibrillarin抗体 | Abcam | ab5821 |
| Cy3标记山羊抗兔IgG | Merck Millipore | AP132C | |
| DAPI | Sigma | -- | |
| EdU/OPP/EU检测 | Click-iT EdU细胞增殖试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Click-iT Plus OPP蛋白合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Click-iT新生RNA捕获试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 高内涵成像 | Yokogawa CV8000高内涵成像仪 | Yokogawa | -- |
| 免疫印迹 | Complete Mini蛋白酶抑制剂 | Roche | -- |
| PhosSTOP磷酸酶抑制剂 | Roche | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗PABP1抗体 | Proteintech | 10970-1 | |
| 抗RPL13A抗体 | Proteintech | 14633-1-AP | |
| 抗RPL23抗体 | Proteintech | 16086-1-AP | |
| 抗β-actin抗体 | Sigma | A1978 | |
| 山羊抗兔HRP偶联二抗 | BioRad | 1705046 | |
| 山羊抗小鼠HRP偶联二抗 | BioRad | 1705047 | |
| ECL免疫印迹底物 | BioRad | 1705061 | |
| 动物实验 | 4-羟基他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | -- |
| 组织学分析 | 10%中性缓冲福尔马林 | Wako | -- |
| 免疫荧光 | 大鼠抗CD44v6抗体 | BioRad | MCA1967 |
| Cy5标记抗大鼠IgG | Jackson | 712-175-153 | |
| 免疫组织化学 | 小鼠抗β-catenin抗体 | BD Biosciences | 610154 |
| Envision+系统HRP标记聚合物 | DAKO | -- | |
| 组织成像 | AxioImager M2显微镜 | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| trametinib处理类器官的单细胞转录组 | trametinib浓度10 nM、处理时间24 h；对照与处理组细胞数；聚类与注释参数 阅读提示：Results第1段及Fig. 1a图注；Methods单细胞RNA测序与分析小节 |
| trametinib处理类器官的免疫印迹与免疫荧光 | trametinib 10 nM、处理24 h（免疫荧光）或6 h（免疫印迹）；生物学重复n=3；分析的PDO数量 阅读提示：Fig. 1e、1j–l图注；Methods全组织免疫荧光与免疫印迹小节 |
| 磷酸化蛋白质组时间进程 | trametinib处理6、24、72 h；生物学重复数；质谱FDR阈值 阅读提示：Fig. 2d图注；Methods磷酸化蛋白质组分析小节 |
| CDK抑制剂及CX-5461与trametinib联用 | 药物滴定剂量范围（4倍IC50至1/16 IC50；非恒定比例2倍至1/4 IC50）；技术复孔数；联合指数判定标准 阅读提示：Methods PDO viability assay小节；Fig. 3a、b、e、f图注 |
| 小鼠肠道肿瘤模型给药 | 4-OHT诱导方案；给药起始时间（诱导后13天）；trametinib 1 mg/kg、CX-5461 100 µg/kg；每日一次连续5天；各组样本量 阅读提示：Methods Animal procedures小节；Fig. 4a、f图注 |
| AMG510处理KRAS G12C类器官 | AMG510浓度与处理时间（活力检测72 h；RNA-seq 100 nM 24 h）；四例PDO来源与突变确认 阅读提示：Methods RNA sequencing与PDO viability assay小节；Fig. 5a、Fig. 6图注；Supplementary Table 3 |