SPLiCR-seq载体的构建与验证
验证SPLiCR-seq载体能否准确反映内源XBP1剪接动态及遗传扰动效果。
构建包含XBP1剪接报告子和sgRNA盒的SPLiCR-seq载体，转染HEK293T细胞，用Tg或Tm处理，通过RT-PCR检测报告子和内源XBP1剪接；用靶向ERN1和EIF2AK3的sgRNA验证扰动效果。
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SPLiCR-seq：一种基于CRISPR的RNA剪接筛选平台，鉴定内质网应激下IRE1α-XBP1信号的新型调控因子
SPLiCR-seq: A CRISPR-Based Screening Platform for RNA splicing Identifies Novel Regulators of IRE1α-XBP1 Signaling Under ER Stress.
实验完整度
高包含体外细胞系、iPSC、原代T细胞及离体CAR-T模型，并进行了CRISPR筛选、多种功能验证和机制验证。
主要模型
HEK293T细胞（CRISPRi-HEK293T） iPSC（CRISPRi-iPSC） CAR-T细胞离体耗竭模型
重点核对
SPLiCR-seq筛选的感染复数（MOI<0.3）和生物学重复数（n=2） CRISPRi-HEK293T和CRISPRi-iPSC细胞中dCas9-BFP-KRAB的表达 ER应激诱导条件：Tg（3 h或24 h）或Tm（24 h）的浓度 Sephin1处理浓度（1-5 μM用于细胞实验；30 μM用于CAR-T共培养）和时间 CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养的效靶比（1:1）和轮次（每3天一轮）
摘要
RNA剪接是细胞功能的基础，然而现有方法限制了对某复杂调控的系统研究。在此，我们提出SPLiCR-seq（通过CRISPR筛选鉴定剪接调控因子），一种高通量CRISPR筛选平台，能够直接测量混合遗传扰动下的RNA剪接结果，克服了传统基于荧光方法的局限性。应用SPLiCR-seq研究未折叠蛋白反应（UPR）期间的XBP1剪接，我们在多种细胞背景下进行了靶向和全基因组筛选，揭示了共同和细胞类型特异性的调控因子。值得注意的是，我们鉴定出GADD34（PPP1R15A）是IRE1α-XBP1信号的新型调节因子，证明它直接与IRE1α相互作用，并且其功能独立于其在eIF2α去磷酸化中的经典作用。使用Sephin1对GADD34进行药理学抑制，在离体模型中有效抑制了XBP1剪接并缓解了CAR-T细胞耗竭，从而在多种癌症模型中增强了肿瘤杀伤能力。这项工作不仅建立了一个用于系统研究RNA剪接调控的强大新工具，还揭示了一种通过调节IRE1α-XBP1通路来改善CAR-T细胞免疫治疗的具有前景的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何系统鉴定RNA剪接的调控因子，并探索IRE1α-XBP1信号在ER应激和CAR-T细胞耗竭中的调控机制？
- 核心机制
- GADD34直接与IRE1α相互作用，调控IRE1α激活和XBP1剪接，且该功能不依赖于其eIF2α去磷酸化作用；Sephin1抑制GADD34可降低XBP1剪接并缓解CAR-T细胞耗竭。
- 主要证据
- 通过SPLiCR-seq在HEK293T和iPSC中进行RBP及全基因组筛选，鉴定GADD34为新型调控因子；利用敲低/敲除、过表达、Co-IP、免疫荧光、RT-PCR和Western blot验证GADD34与IRE1α的相互作用及功能；在离体CAR-T耗竭模型中验证Sephin1的效果。
- 研究意义
- SPLiCR-seq为系统研究RNA剪接调控提供了新工具；GADD34抑制可能成为改善CAR-T细胞免疫治疗的一种策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RBP聚焦的SPLiCR-seq筛选
鉴定XBP1剪接的RNA结合蛋白调控因子，并比较不同细胞类型的差异。
构建靶向1,350个人类RBP的sgRNA文库，转导CRISPRi-HEK293T和CRISPRi-iPSC，嘌呤霉素筛选后Tg处理3 h，提取RNA进行配对末端NGS，计算剪接表型。
全基因组SPLiCR-seq筛选
全面鉴定不同ER应激条件下IRE1α-XBP1信号的调控因子。
构建靶向11,120个基因的全基因组CRISPRi文库，转导CRISPRi-HEK293T，分别用Tg或Tm处理24 h，进行SPLiCR-seq筛选。
批量验证筛选及GADD34（PPP1R15A）的个体验证
验证全基因组筛选的高置信度命中，并确认PPP1R15A对XBP1剪接的调控作用。
使用靶向70个选定命中的定制文库进行二次筛选，测试1、8、24 h的Tg处理；对PPP1R15A进行敲低、过表达 Rescue、敲除，用RT-PCR和Western blot检测XBP1剪接及蛋白水平；用Sephin1处理验证药理学抑制效果。
GADD34调控机制的验证
探究GADD34调控IRE1α-XBP1信号是否依赖eIF2α去磷酸化，并验证GADD34与IRE1α的直接相互作用。
在PPP1R15A敲低/敲除细胞中检测eIF2α磷酸化；在EIF2S1敲低/部分敲除细胞中测试Sephin1效果；用ISRIB处理；通过Co-IP和免疫荧光分析GADD34与IRE1α的相互作用及结构域 mapping。
GADD34抑制对CAR-T细胞耗竭的影响
评估Sephin1抑制GADD34对CAR-T细胞耗竭和肿瘤杀伤能力的影响。
建立CAR-T细胞与肿瘤细胞的连续共培养耗竭模型，在DMSO或Sephin1存在下进行多轮共培养，检测XBP1剪接、细胞因子分泌、细胞增殖和肿瘤细胞清除。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良 eagle 培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | TransGen Biotech | FS301-02 | |
| 青霉素-链霉素 | Aladdin | P301861 | |
| StemFlex培养基 | Gibco | A3349401 | |
| 基质胶 | Corning | 356231 | |
| ROCK抑制剂 | Selleck | S1049 | |
| RPMI1640培养基 | Gibco | C11875500BT | |
| GlutaMax添加剂 | Thermo | 35050061 | |
| Click培养基 | Mesgen | MCM4125 | |
| MycAway™ Plus-Color一步法支原体检测试剂盒 | Yeasen | 40612ES25 | |
| 载体构建 | ClonExpress® Ultra一步法克隆试剂盒 | Vazyme | C115 |
| 慢病毒包装 | Opti-MEM培养基 | Gibco | 31986-07 |
| 线性聚乙烯亚胺（PEI）MW40000 | Yeasen | 40816ES03 | |
| 0.45微米滤器 | Millipore | SLHV033RB | |
| RNA提取与逆转录 | MolPure®细胞RNA提取试剂盒 | Yeasen | 19231ES50 |
| TransScript®一步法gDNA去除与cDNA合成预混液 | TransGen | AT311-03 | |
| qPCR | AceQ qPCR SYBR Green预混液 | Vazyme | CQ111-02 |
| RT-PCR | 2×Hieff®PCR预混液（含染料） | Yeasen | 10102ES03 |
| 药物处理 | 毒胡萝卜素 | Santa Cruz | sc-24017 |
| 衣霉素 | Beyotime | SC0393 | |
| 二硫苏糖醇 | BBI | B645939 | |
| Sephin1 | MCE | HY-111022 | |
| trans-ISRIB | Tocris | 5284 | |
| 文库构建 | Phanta Flash预混液 | Vazyme | P520 |
| SPLiCR-seq筛选 | BeyoMag™ mRNA磁珠纯化试剂盒 | Beyotime | R0071M |
| TransScript® II一步法gDNA去除与cDNA合成预混液 | TransGen | AH311 | |
| 2×Phanta Flash预混液聚合酶 | Vazyme | P510 | |
| Hieff NGS® DNA选择磁珠 | Yeasen | 12601ES08 | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 磷酸酶抑制剂 cocktail | Selleck | B15001 | |
| 蛋白酶抑制剂 cocktail | MCE | HY-K0010 | |
| Easy II蛋白定量试剂盒 | TransGen | DQ111 | |
| 上样缓冲液 | Solarbio | P1041 | |
| 0.45微米PVDF膜 | Immobilon | IPVH00010 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | V900933 | |
| TBST缓冲液 | Sangon | C520009 | |
| Clarity Western ECL底物 | EpiZyme | SQ202L, SQ201 | |
| 抗PERK抗体 | Proteintech | 20582-1-AP | |
| 抗磷酸化IRE1α抗体 | Abcam | ab124945 | |
| 抗IRE1α抗体 | CST | 3294 | |
| 抗GADD34抗体 | Proteintech | 10449-1-AP | |
| 抗XBP1s抗体 | CST | 12782 | |
| 抗磷酸化eIF2α抗体 | CST | 9721S | |
| 抗eIF2α抗体 | CST | 5324 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | HRP-60004 | |
| 抗Flag抗体 | Absin | Abs830014 | |
| 抗HA抗体 | Sigma | H3663 | |
| 抗GFP抗体 | Ray Antibody | RM1108 | |
| 抗兔IgG抗体 | CST | 7074S | |
| 抗鼠IgG抗体 | CST | 7076S | |
| 免疫共沉淀 | 裂解缓冲液 | Beyotime | P2181S-1 |
| Deoxy Big CHAP | BBI | A600681-0250 | |
| 抗Flag磁珠 | Beyotime | P2181S-4 | |
| 抗IgG磁珠 | Beyotime | P2171 | |
| 抗HA磁珠 | Beyotime | P2121 | |
| 抗GFP琼脂糖珠 | ABMagic | MA108-25T | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Coolaber | CT11451 |
| 抗钙联蛋白抗体 | Proteintech | 10427-2-AP | |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| 封片剂 | SouthernBiotech | 0100 | |
| T细胞转导 | 抗CD3抗体 | Biolegend | 317326 |
| 抗CD28抗体 | BD Biosciences | 555725 | |
| 重组纤连蛋白 | Takara | T100B | |
| T细胞培养 | 白细胞介素-7 | PeproTech | 200-07-500 |
| 白细胞介素-15 | PeproTech | 200-15-500 | |
| 细胞内细胞因子染色 | 佛波酯 | Beyotime | S1819 |
| 离子霉素 | Beyotime | S1672 | |
| 布雷非德菌素A | Biolegend | 420601 | |
| Zombie Aqua活性染料 | Biolegend | 423102 | |
| BD Cytofix/Cytoperm™固定/透化试剂盒 | BD Bioscience | 554714 | |
| 流式细胞术 | AF700标记抗CD8抗体 | Biolegend | clone SK-1 |
| AF647标记抗IFN-γ抗体 | Biolegend | clone 4S.B3 | |
| PE标记抗TNF-α抗体 | Biolegend | clone MAB11 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SPLiCR-seq筛选 | 感染复数（MOI<0.3）；嘌呤霉素筛选浓度（2 μg/mL）和时间（48 h）；Tg或Tm处理浓度和时间（Tg 3 h用于RBP筛选，24 h用于全基因组筛选；Tm 24 h；浓度文中未明确说明）；生物学重复数（n=2） 阅读提示：Methods中“SPLiCR-seq screening and data analysis”小节及Figure 2A、3A图注 |
| GADD34功能验证 | sgRNA序列（文中未明确说明，见Supplementary Data 2）；Sephin1浓度（1-5 μM）和处理时间（3或24 h）；Tg浓度（500 nM）和时间（0、6、24 h）；Tm浓度（2 μM）和时间（24 h） 阅读提示：Methods中“Drug treatment”小节及Figure 4、5图注 |
| CAR-T细胞耗竭模型 | 效靶比（1:1）；Sephin1浓度（30 μM）；共培养轮次（每3天一轮，共3轮）；技术重复（n=4）和实验重复（n=5）；细胞因子浓度（IL-7 10 ng/mL，IL-15 5 ng/mL） 阅读提示：Methods中“Ex-vivo exhaustion model”和“Transduction of human T cells”小节及Figure 7A图注 |
| 免疫共沉淀 | 细胞数（5 × 10⁶ HEK293T）；转染质粒（pcDNA3.1-GFP-GADD34系列和PCDH-FL GADD34-3×Flag）；抗体用量（文中未明确说明）；孵育时间（4°C过夜） 阅读提示：Methods中“Co-immunoprecipitation (Co-IP)”小节及Figure 6B、C图注 |