HRD1介导的泛素化对TLR3转运及其天然免疫信号传导至关重要

Ubiquitination by HRD1 is essential for TLR3 trafficking and its innate immune signaling.

作者信息Lianfeng Zhao, Zinan He, Yao Sun, Mengqi Sun, Zheyi Liu, Zhangsen Zhou, Ling Qi, Yuan Luo, Yewei Ji, Tingbo Liang

PMID41372171

期刊Nat Commun

发布时间2025-12-10

DOI10.1038/s41467-025-67219-0

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实验完整度

高

包含巨噬细胞、HEK293T、MEF体外模型，CRISPR敲除、敲低、过表达、抑制剂、泛素化、转运定位及TLR3 K813R敲入小鼠体内验证等多层级功能与机制实验

主要模型

RAW 264.7巨噬细胞（WT与Hrd1−/−）原代腹腔巨噬细胞与BMDM HEK293T-TLR3稳定表达细胞（WT与Hrd1−/−） TLR3K813R敲入小鼠及C57BL/6J小鼠

重点核对

poly(I:C)处理浓度50 μg/ml及所示时间点 LS-102使用浓度5 μM处理24 h（体外）或10 mg/kg体重/天连续3天（体内） Hrd1−/−与WT细胞的CRISPR/Cas9敲除及对照 TLR3 K813R敲入小鼠基因型鉴定及WT同窝对照体内poly(I:C) 0.7 mg/kg体重联合D-GalN 0.5 g/kg体重注射

摘要

Toll样受体3（TLR3）是一种双链RNA（dsRNA）的天然免疫传感器，合成后从内质网（ER）转运至内溶酶体进行蛋白水解切割和激活。然而，调控TLR3转运的分子机制在很大程度上仍不清楚。在此，我们鉴定出ER驻留E3连接酶HMG-CoA还原酶降解蛋白1（HRD1）——ER相关降解（ERAD）的核心组分——是促进TLR3转运及下游信号传导的关键调控因子。巨噬细胞中HRD1缺失显著削弱了poly(I:C)诱导的TLR3信号传导和炎症反应（体外和体内），这是由TLR3进入内溶酶体的转运及随后的蛋白水解加工显著减少所致。机制上，HRD1介导ER定位的TLR3在赖氨酸813位点的泛素化，这是其被转运必需的内体分选复合物（ESCRT）机器识别和分选所必需的。HRD1的这一功能与其经典的ERAD活性及ER应激传感器肌醇需求酶1α（IRE1α）解耦联。因此，我们的研究鉴定了一种先前未被认识的控制TLR3信号传导的机制，并将HRD1介导的泛素化与天然免疫应答中免疫传感器的转运联系起来。

鉴定HRD1与TLR3的相互作用

筛选并验证HRD1与TLR3的物理互作及结构域需求。

在WT与Hrd1−/− RAW264.7细胞中进行抗HRD1免疫共沉淀-质谱（CoIP-MS）；在HEK293T细胞中共转染TLR3-Flag与HRD1-Myc并进行免疫共沉淀；利用截短突变体定位互作结构域。

验证HRD1对TLR3信号传导的正向调控

确定HRD1缺失或抑制对TLR3下游信号及炎症反应的影响。

比较WT与Hrd1−/− RAW264.7、HEK293T-TLR3细胞中TBK1、IRF3、P65、IκBα磷酸化；使用siRNA敲低Hrd1或LS-102处理原代巨噬细胞；qPCR检测炎症基因，ELISA检测细胞因子；HSV-1复制实验评估分泌组抗病毒活性。

解析HRD1与TLR3信号的正反馈环路

探究TLR3信号是否上调HRD1表达及HRD1如何影响TLR3转录。

qPCR检测Hrd1、Ets1、Tlr3、Irf1、Irf2转录；免疫印迹检测ERK1/2、STAT1磷酸化；使用PD98059、LS-102、Fludarabine及细胞因子回补实验。

排除ERAD和UPR通路对HRD1调控TLR3的贡献

检验HRD1对TLR3信号的影响是否依赖其经典ERAD活性或UPR。

检测WT与Hrd1−/−细胞中全长TLR3丰度及CHX追踪降解；使用Eeyarestatin I抑制VCP/ERAD、毒胡萝卜素诱导ER应激、4μ8c抑制IRE1α，检测炎症基因表达。

验证HRD1对TLR3的泛素化修饰及链型

确定HRD1是否直接泛素化TLR3及泛素链类型和关键结构域。

体内外泛素化实验；使用HRD1 C2A、ΔRING、ΔTM突变体；泛素K48R、K63R及K48-only、K63-only突变体；Brefeldin A阻断ER到高尔基转运；检测VCP、SEL1L、BIP、OS9与TLR3的相互作用。

验证HRD1促进TLR3向內溶酶体转运及切割

确定HRD1缺失是否阻断TLR3从ER经高尔基向內溶酶体的转运和切割。

共聚焦显微镜检测TLR3与KDEL、TGN38、LAMP1、Calnexin、GM130、Rab5、Rab7共定位；Endo H/PNGase F糖苷酶处理；分离ER、高尔基和内体组分进行免疫印迹；检测ESCRT组分HRS、TSG101、VPS36与TLR3的结合。

定位HRD1介导的TLR3泛素化关键位点K813

确定HRD1泛素化TLR3的具体赖氨酸位点及其功能重要性。

构建TLR3胞质域11个K→R突变体筛选泛素化位点；在MEF中稳定表达WT或K813R TLR3-Flag，检测切割、糖苷酶敏感性、细胞器分布及下游信号。

体内验证HRD1-TLR3 K813泛素化对炎症的作用

评估HRD1抑制及TLR3 K813R突变对poly(I:C)诱导小鼠炎症和致死率的影响。

LS-102预处理C57BL/6J小鼠后注射poly(I:C)±D-GalN，检测血清细胞因子、存活率、肺HE染色和肝TUNEL；构建TLR3K813R敲入小鼠，分离BMDM检测信号，并进行体内poly(I:C)挑战。

实验环节	名称	品牌	货号
细胞培养与药物处理	高分子量聚肌胞苷酸	InvivoGen	tlrl-pic
LS-102	MedChemExpress	--
Eeyarestatin I	MedChemExpress	--
4μ8c	MedChemExpress	--
毒胡萝卜素	EMD Calbiochem	--
MG132	MedChemExpress	--
布雷菲德菌素A	Sellck	--
细胞培养	DMEM培养基	Cytiva	--
胎牛血清	Braserum	--
BMDM诱导	巨噬细胞集落刺激因子	PeproTech	--
Western blot	Flag抗体	Sigma	F1804
HA抗体	Proteintech	51064-2-AP
HRD1抗体	Proteintech	13473-1-AP
SEL1L抗体	Abclonal	A12073
IRE1α抗体	Cell Signaling	3294
PERK抗体	Proteintech	20582-1-AP
Eif2α抗体	Cell Signaling	5324
磷酸化Eif2α抗体	Cell Signaling	5324
β-微管蛋白抗体	Proteintech	10068-1-AP
HSP90抗体	Proteintech	13171-1-AP
Myc抗体	ABclonal	AE010
V5抗体	ABclonal	AE017
磷酸化IκBα抗体	ABclonal	AP0707
HRS抗体	ABclonal	A1790
TSG101抗体	ABclonal	A1692
VPS36抗体	ABclonal	A15157
TLR3抗体	NOVUS	NBP2-24875
磷酸化TBK1 (Ser172)抗体	Cell Signaling	D52C2
TBK1抗体	Cell Signaling	E9H5S
磷酸化IRF3 (Ser396)抗体	Cell Signaling	D601M
IRF3抗体	Cell Signaling	D83B9
IκBα抗体	Cell Signaling	9242
β-肌动蛋白抗体	Cell Signaling	13E5
p65抗体	Cell Signaling	D14E12
磷酸化p65抗体	Cell Signaling	93H1
K48连接特异性泛素抗体	Cell Signaling	D9D5
K63连接特异性泛素抗体	Cell Signaling	D7A11
GOLPH2抗体	ABclonal	A26409PM
EEA1抗体	ABclonal	A5057
泛素抗体	Santa Cruz	P4D1
TGN38抗体	Santa Cruz	sc-166594
小鼠IgG	Santa Cruz	sc-2025
兔IgG	Abclonal	AC005
ERK1/2抗体	Cell Signaling	4695
磷酸化ERK1/2抗体	Cell Signaling	9101
STAT1抗体	Cell Signaling	14994
磷酸化STAT1抗体	Cell Signaling	9167
免疫共沉淀	Protein A/G PLUS琼脂糖珠	Santa Cruz	--
Western blot	Endo H	New England BioLab	--
PNGase F	New England BioLab	--
细胞培养与转染	lipo8000转染试剂	Beyotime	--
双荧光素酶报告基因实验	双荧光素酶报告基因检测系统	Promega	--
体外泛素化	E1泛素激活酶	Abcam	ab139467
E2泛素结合酶UBE2G2	MedChemExpress	--
泛素化缓冲液	Abcam	ab139467
细胞器分离	内质网富集试剂盒	Invent Biotechnologies	--
高尔基体富集试剂盒	Invent Biotechnologies	--
内体分离和细胞分级试剂盒	Invent Biotechnologies	--
ELISA	小鼠TNFα ELISA试剂盒	BioLegend	--
小鼠IL6 ELISA试剂盒	BioLegend	--
小鼠IFNβ ELISA试剂盒	BioLegend	--
TUNEL染色	一步法TUNEL凋亡检测试剂盒	Beyotime	--
免疫荧光	TLR3抗体	Proteintech	17766-1-AP
Calnexin抗体	Proteintech	10427-2-AP
GM130抗体	Proteintech	11308-1-AP
Rab5抗体	Cell Signaling	C8B1
Rab7抗体	Cell Signaling	D95F2
KDEL抗体	Novus Biologicals	NBP1-97469
TGN38抗体	Santa Cruz	sc-166594
LAMP1抗体	Proteintech	65050-1-Ig
Flag抗体	Sigma	F1804
含DAPI的抗淬灭封片剂	Beyotime	--
体内poly(I:C)挑战	D-半乳糖胺	Sigma-Aldrich	G1639
聚肌胞苷酸	InvivoGen	tlrl-pic

实验环节

名称

品牌

货号

细胞培养与药物处理

高分子量聚肌胞苷酸

InvivoGen

tlrl-pic

MedChemExpress

MedChemExpress

MedChemExpress

EMD Calbiochem

MedChemExpress

Sellck

细胞培养

DMEM培养基

Cytiva

胎牛血清

Braserum

BMDM诱导

巨噬细胞集落刺激因子

PeproTech

Western blot

Flag抗体

Sigma

F1804

HA抗体

Proteintech

51064-2-AP

HRD1抗体

Proteintech

13473-1-AP

SEL1L抗体

Abclonal

A12073

IRE1α抗体

Cell Signaling

3294

PERK抗体

Proteintech

20582-1-AP

Eif2α抗体

Cell Signaling

5324

磷酸化Eif2α抗体

Cell Signaling

5324

β-微管蛋白抗体

Proteintech

10068-1-AP

HSP90抗体

Proteintech

13171-1-AP

Myc抗体

ABclonal

AE010

V5抗体

ABclonal

AE017

磷酸化IκBα抗体

ABclonal

AP0707

HRS抗体

ABclonal

A1790

TSG101抗体

ABclonal

A1692

VPS36抗体

ABclonal

A15157

TLR3抗体

NOVUS

NBP2-24875

磷酸化TBK1 (Ser172)抗体

Cell Signaling

D52C2

TBK1抗体

Cell Signaling

E9H5S

磷酸化IRF3 (Ser396)抗体

Cell Signaling

D601M

IRF3抗体

Cell Signaling

D83B9

IκBα抗体

Cell Signaling

9242

β-肌动蛋白抗体

Cell Signaling

13E5

p65抗体

Cell Signaling

D14E12

磷酸化p65抗体

Cell Signaling

93H1

K48连接特异性泛素抗体

Cell Signaling

D9D5

K63连接特异性泛素抗体

Cell Signaling

D7A11

GOLPH2抗体

ABclonal

A26409PM

EEA1抗体

ABclonal

A5057

泛素抗体

Santa Cruz

P4D1

TGN38抗体

Santa Cruz

sc-166594

小鼠IgG

Santa Cruz

sc-2025

兔IgG

Abclonal

AC005

ERK1/2抗体

Cell Signaling

4695

磷酸化ERK1/2抗体

Cell Signaling

9101

STAT1抗体

Cell Signaling

14994

磷酸化STAT1抗体

Cell Signaling

9167

免疫共沉淀

Protein A/G PLUS琼脂糖珠

Santa Cruz

Western blot

Endo H

New England BioLab

PNGase F

New England BioLab

细胞培养与转染

lipo8000转染试剂

Beyotime

双荧光素酶报告基因实验

双荧光素酶报告基因检测系统

Promega

体外泛素化

E1泛素激活酶

Abcam

ab139467

E2泛素结合酶UBE2G2

MedChemExpress

泛素化缓冲液

Abcam

ab139467

细胞器分离

内质网富集试剂盒

Invent Biotechnologies

高尔基体富集试剂盒

Invent Biotechnologies

内体分离和细胞分级试剂盒

Invent Biotechnologies

ELISA

小鼠TNFα ELISA试剂盒

BioLegend

小鼠IL6 ELISA试剂盒

BioLegend

小鼠IFNβ ELISA试剂盒

BioLegend

TUNEL染色

一步法TUNEL凋亡检测试剂盒

Beyotime

免疫荧光

TLR3抗体

Proteintech

17766-1-AP

Calnexin抗体

Proteintech

10427-2-AP

GM130抗体

Proteintech

11308-1-AP

Rab5抗体

Cell Signaling

C8B1

Rab7抗体

Cell Signaling

D95F2

KDEL抗体

Novus Biologicals

NBP1-97469

TGN38抗体

Santa Cruz

sc-166594

LAMP1抗体

Proteintech

65050-1-Ig

Flag抗体

Sigma

F1804

含DAPI的抗淬灭封片剂

Beyotime

体内poly(I:C)挑战

D-半乳糖胺

Sigma-Aldrich

G1639

聚肌胞苷酸

InvivoGen

tlrl-pic

环节	核对要点
HRD1-TLR3互作验证	poly(I:C)处理浓度50 μg/ml及各时间点；HEK293T转染后处理时间3 h；RAW264.7处理时间点阅读提示：Methods细胞培养与药物处理；Fig. 1图注
HRD1缺失或抑制对TLR3信号的影响	LS-102浓度5 μM、处理24 h；poly(I:C) 50 μg/ml；ELISA刺激后6 h；Hrd1−/−细胞系构建及对照阅读提示：Methods细胞培养与CRISPR介导基因敲除；Fig. 2图注
Hrd1敲低实验	siRNA序列及转染条件：文中未明确说明转染试剂、浓度和时间阅读提示：Methods siRNA小节
泛素化实验	LS-102 5 μM处理8 h；Brefeldin A 10 μg/ml处理8 h；体外泛素化37 °C 3 h；E1/E2用量：文中未明确说明阅读提示：Methods体外泛素化实验；Fig. 5图注
TLR3转运与切割检测	poly(I:C) 50 μg/ml处理不同时间；细胞器分离试剂盒操作步骤；共聚焦抗体稀释比例；Endo H/PNGase F处理条件按说明书阅读提示：Methods免疫荧光、细胞器分离、Western blot；Fig. 6图注
TLR3 K813R敲入小鼠体内实验	poly(I:C) 0.7 mg/kg体重；D-GalN 0.5 g/kg体重；LS-102 10 mg/kg体重/天连续3天；血清2 h、组织4 h；每组n=6-17；小鼠性别和年龄匹配阅读提示：Methods小鼠、Poly(I:C)挑战、组织HE和TUNEL染色；Fig. 8图注
BMDM分化	M-CSF 50 ng/ml处理3-5天阅读提示：Methods生成BMDMs
HSV-1感染实验	secretome刺激18 h；HSV-1 MOI 0.5或1.0；感染24 h 阅读提示：Methods HSV1感染；Fig. 2f图注

环节

核对要点

HRD1-TLR3互作验证

poly(I:C)处理浓度50 μg/ml及各时间点；HEK293T转染后处理时间3 h；RAW264.7处理时间点

阅读提示：Methods细胞培养与药物处理；Fig. 1图注

HRD1缺失或抑制对TLR3信号的影响

LS-102浓度5 μM、处理24 h；poly(I:C) 50 μg/ml；ELISA刺激后6 h；Hrd1−/−细胞系构建及对照

阅读提示：Methods细胞培养与CRISPR介导基因敲除；Fig. 2图注

Hrd1敲低实验

siRNA序列及转染条件：文中未明确说明转染试剂、浓度和时间

阅读提示：Methods siRNA小节

泛素化实验

LS-102 5 μM处理8 h；Brefeldin A 10 μg/ml处理8 h；体外泛素化37 °C 3 h；E1/E2用量：文中未明确说明

阅读提示：Methods体外泛素化实验；Fig. 5图注

TLR3转运与切割检测

poly(I:C) 50 μg/ml处理不同时间；细胞器分离试剂盒操作步骤；共聚焦抗体稀释比例；Endo H/PNGase F处理条件按说明书

阅读提示：Methods免疫荧光、细胞器分离、Western blot；Fig. 6图注

TLR3 K813R敲入小鼠体内实验

poly(I:C) 0.7 mg/kg体重；D-GalN 0.5 g/kg体重；LS-102 10 mg/kg体重/天连续3天；血清2 h、组织4 h；每组n=6-17；小鼠性别和年龄匹配

阅读提示：Methods小鼠、Poly(I:C)挑战、组织HE和TUNEL染色；Fig. 8图注

BMDM分化

M-CSF 50 ng/ml处理3-5天

阅读提示：Methods生成BMDMs

HSV-1感染实验

secretome刺激18 h；HSV-1 MOI 0.5或1.0；感染24 h

阅读提示：Methods HSV1感染；Fig. 2f图注

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