合成细胞与癌细胞共组装形成杂合肿瘤球
评估不同合成细胞模型整合到自组装肿瘤球中的能力。
将多种合成细胞模型（GUVs、凝聚层、胶体体、DSLB、蛋白体）与单细胞化的癌细胞系共孵育，在低黏附表面诱导自组装形成肿瘤球，并定量整合效率。
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整合活细胞与合成细胞的杂合3D培养物自组装
Self-assembly of hybrid 3D cultures by integrating living and synthetic cells.
实验完整度
高包含多种癌细胞系3D肿瘤球、合成细胞整合定量、活细胞成像、TEM、RNA-seq、磷酸化蛋白组、原代T细胞功能及患者队列生存分析。
主要模型
Panc-1细胞系自组装肿瘤球 其他癌细胞系（BT-474、MCF-7、Capan-1、Capan-2）肿瘤球 DSLB等合成细胞模型 原代人类CD8+ T细胞 PDAC患者转录组队列（TCGA/GTEx）
重点核对
DSLB与Panc-1细胞比例1:10（若无特别说明），用于杂合肿瘤球形成；RNA-seq中比例为1:3，磷酸化蛋白组中比例为1:8，BiTE实验中比例为1:10。 合成细胞与肿瘤球共培养48小时，在37°C、5% CO2、100%湿度下成熟。 重组蛋白以300分子/µm²密度偶联到DSLB膜上，蛋白与DGS-NTA(Ni2+)摩尔比2:1。 RNA-seq在三个生物学重复中进行，每样本约40-60M单端75nt reads。 BiTE实验中使用抗Her2-CD3双特异性抗体（BSAB-002），浓度0.1-100 pM，T细胞与Panc-1细胞比例1:2，共培养12-48小时。
摘要
自组装是生命物质的基本特性，驱动组织和器官等细胞集体的三维组织化。本文利用合成细胞与天然细胞的共组装来创建杂合活体3D癌症培养物。我们筛选了一系列合成细胞模型，评估其形成具有人工但可控微环境的增强型肿瘤球的能力，并证明细胞间和细胞外黏附的平衡以及合成细胞表面张力是驱动整合性共组装的关键材料特性。我们证明基于液滴支撑脂质双层的合成细胞可以建立人工肿瘤免疫微环境（ART-TIME），在肿瘤球内模拟免疫原性信号，从而无需整合复杂的活免疫细胞。利用ART-TIME方法，我们确定了PD-1与CD2之间由AhR-ARNT介导的共信号机制是胰腺导管腺癌免疫逃逸的驱动因素。我们的研究推进了杂合类器官工程领域，为人工肿瘤环境的构建和建模提供了机会，并朝着功能性活/非活细胞拟态材料的设计迈出了一步。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 合成细胞能否通过自组装整合到活细胞3D培养物中，并用于构建人工肿瘤免疫微环境以研究免疫受体共信号？
- 核心机制
- PD-1/CD2共信号通过蛋白激酶和p53介导的下游信号，调控包括ARNT在内的转录因子，促进可溶性免疫抑制因子PD-L1和CCL2分泌，从而驱动PDAC免疫逃逸。
- 主要证据
- 多种合成细胞模型与癌细胞系共组装形成杂合肿瘤球；DSLB整合受黏附平衡和表面张力调控；ART-TIME结合RNA-seq、磷酸化蛋白组、原代T细胞功能实验及患者队列生存分析验证PD-1/CD2共信号功能。
- 研究意义
- 推进杂合类器官工程，为人工肿瘤环境的构建和建模提供机会，并朝功能性活/非活细胞拟态材料设计迈进一步。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
解析杂合肿瘤球组装机制与合成-天然细胞界面
阐明合成细胞整合的生物物理机制及界面特性。
活细胞成像观察组装过程；共聚焦和TEM分析界面；检测血清蛋白调理与整合效率的相关性；分析细胞黏附蛋白表达比例；利用PEG化DSLB验证黏附作用；通过重组CD40L偶联DSLB验证受体-配体信号。
构建ART-TIME并筛选免疫受体共信号
利用合成细胞呈递免疫配体，系统筛选PD-1共信号受体。
将PD-1与多种免疫配体（CD2、CD27、CD40L、CTLA-4、LAG3、ICOS、TIGIT）共偶联到DSLB表面，与Panc-1细胞形成杂合肿瘤球，通过RNA-seq和差异表达分析鉴定共信号效应。
验证PD-1/CD2共信号的信号通路与功能
确定PD-1/CD2共信号激活的下游通路及对免疫抑制表型的影响。
对PD-1、CD2或PD-1/CD2 ART-TIME肿瘤球进行磷酸化蛋白组分析；收集条件培养基处理原代T细胞，检测T细胞活化标志物和细胞因子分泌；在BiTE杀伤实验中评估T细胞活化。
分析PD-1/CD2共信号的临床相关性
评估PD-1/CD2配体共表达与PDAC患者生存的关系。
利用TCGA和GTEx的PDAC转录组数据，分析CD58/PD-L1共表达与总生存期的相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640（含L-谷氨酰胺） | VWR | -- |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| DSLB组装 | PDMS（Sylgard 184） | Dow Corning | -- |
| 氯化镁 | Sigma Aldrich | -- | |
| 鸡蛋卵磷脂酰胆碱 | Avanti Polar Lipids | -- | |
| 鸡蛋卵磷脂酰甘油 | Avanti Polar Lipids | -- | |
| PE-DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | -- | |
| 丽丝罗丹明B-PE | Avanti Polar Lipids | -- | |
| Atto488-PE | Avanti Polar Lipids | -- | |
| PEG750头基修饰的16:0 PE脂质 | Avanti Polar Lipids | -- | |
| 重组蛋白偶联 | 重组人PD-1（ECD，His标签） | Sino Biological | 10377-H08H |
| 重组人CD2（ECD，His标签） | Sino Biological | 10982-H08H | |
| 重组人CD27（His标签） | Sino Biological | 10039-H08B1 | |
| 重组人CD40配体（His标签） | Sino Biological | 10239-H08E | |
| 重组人CTLA-4（His标签） | Sino Biological | 11159-H08H | |
| 重组人LAG-3（ECD，His标签） | Sino Biological | 16498-H08H | |
| 重组人ICOS（His & hFc标签） | Sino Biological | 10344-H03H | |
| 重组人TIGIT（ECD，His标签） | Sino Biological | 10917-H08H-B | |
| 杂交瘤球形成 | Nunc 96孔平底板 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 0.25%胰蛋白酶-EDTA（HBSS中） | VWR | -- | |
| Neubauer改进计数板 | Marienfeld | -- | |
| RNA提取与qPCR | RNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| 无RNase DNase套装 | Qiagen | -- | |
| 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| QuantStudio 5实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| NanoDrop分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RNA测序 | NEBnext Ultra II定向RNA文库试剂盒（Illumina） | New England Biolabs (NEB) | -- |
| NEBnext文库定量试剂盒（Illumina） | New England Biolabs (NEB) | -- | |
| NextSeq500测序仪 | Illumina | -- | |
| T细胞分离与培养 | RosetteSep人CD8+ T细胞富集鸡尾酒 | STEMCELL technologies | -- |
| 非必需氨基酸 | Biowest | -- | |
| HEPES | Sigma Aldrich | -- | |
| 重组人IL-2 | STEMCELL technologies | -- | |
| T细胞活化 | Dynabeads人T细胞活化CD3/CD28磁珠 | Gibco | -- |
| 流式分析 | 抗CD25 AlexaFluor488（BC96） | BioLegend | -- |
| 抗CD69 AlexaFluor647（FN50） | BioLegend | -- | |
| Attune NxT流式细胞仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| FlowJo V.10软件 | FlowJo LLC | -- | |
| 磷酸化蛋白组 | Proteome Profiler人磷酸化激酶阵列试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 抑肽酶 | R&D Systems | -- | |
| 亮抑酶肽半硫酸盐 | R&D Systems | -- | |
| 胃蛋白酶抑制剂A | R&D Systems | -- | |
| BCA蛋白检测试剂盒 | Merck | -- | |
| IRDye 800CW链霉亲和素 | LI-COR Biotechnology | -- | |
| ODYSSEY M成像系统 | LI-COR Biotechnology | -- | |
| BiTE实验 | 抗Her2-CD3双特异性T细胞衔接抗体（BSAB-002） | Creative Biolabs | BSAB-002 |
| LDH实验 | LDH-Cytox检测试剂盒 | BioLegend | -- |
| ELLA实验 | 定制Simple Plex检测卡盒 | Biotechne | -- |
| Ella自动ELISA系统 | Biotechne | -- | |
| Western blot | 抗E-钙黏蛋白（60335-1-Ig） | Proteintech | 60335-1-Ig |
| 抗整合素β1（82729-3-RR） | Proteintech | 82729-3-RR | |
| 抗整合素α1β1（22146-1-AP） | Proteintech | 22146-1-AP | |
| 抗整合素α2β1（30703-1-AP） | Proteintech | 30703-1-AP | |
| 抗整合素α5β1（68561-1-Ig） | Proteintech | 68561-1-Ig | |
| 抗整合素α6β1（66906-1-Ig） | Proteintech | 66906-1-Ig | |
| 抗钙联蛋白（10427-2-AP） | Proteintech | 10427-2-AP | |
| IRDye® 680LT山羊抗兔IgG二抗 | LI-COR Biosciences | 926-68021 | |
| IRDye® 800CW山羊抗兔IgG二抗 | LI-COR Biosciences | 926-32211 | |
| IRDye® 800CW山羊抗鼠IgG二抗 | LI-COR Biosciences | 926-32210 | |
| Pierce BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Trans-Blot Turbo半干转印系统 | Bio-Rad | -- | |
| Odyssey CLx荧光成像系统 | LI-COR Biosciences | -- | |
| 膜交换实验 | 18:0花菁5 PE | Avanti Polar Lipids | -- |
| Hoechst染料 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 光片显微镜 | 小麦胚芽凝集素AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| ZEISS Lightsheet Z.1显微镜 | Carl Zeiss AG | -- | |
| 共聚焦显微镜 | LSM 880激光扫描显微镜 | Carl Zeiss AG | -- |
| Plan-Apochromat 63x/1.4油镜DIC M27 | Carl Zeiss AG | -- | |
| Nunc LabTeK玻璃底腔室载玻片 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 其他合成细胞组装 | 聚二烯丙基二甲基氯化铵/三磷酸腺苷 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 杂合肿瘤球形成 | 细胞系来源（ATCC货号HTB-22、HTB-20、CRL-1469、HTB-79、HTB-80）、细胞接种密度（5×10^4至1×10^5细胞/孔）、合成细胞与天然细胞比例（1:22至1:8，DSLB和胶体体）、培养基血清浓度（Panc-1、MCF-7、BT-474为10% FBS；Capan-1、Capan-2为20% FBS）、培养时间48小时。 阅读提示：Methods: Cell culture of Panc-1 culture, MCF-7 culture, Capan-1, Capan-2, BT-474; Hybrid assembly protocol |
| DSLB组装 | PDMS用量（100 mg）、SDS浓度（1 mM）、MgCl2终浓度（40 mM）、SUV脂质组成（74 mol% EggPC, 20 mol% EggPG, 5 mol% PE-DGS-NTA(Ni2+), 1 mol%荧光脂质）、PEG化DSLB中PEG750-PE终浓度（10 mol%）、离心参数（8600×g，30秒）。 阅读提示：Methods: DSLB assembly |
| 重组蛋白偶联 | 蛋白与DGS-NTA(Ni2+)摩尔比（2:1）、最终蛋白密度（300分子/µm²）、孵育条件（4°C，60分钟，避光）、洗涤次数（一次离心重悬）。 阅读提示：Methods: Recombinant protein coupling protocol |
| RNA-seq与差异表达分析 | 杂交瘤球中细胞与DSLB比例（1:3）、生物学重复数（三个）、每样本总RNA量（150 ng）、测序平台（NextSeq500）、读长（1×75 nt单端）、比对基因组（hg38）、差异分析软件（DESeq2）。 阅读提示：Methods: RNAseq, DEG analysis |
| 磷酸化蛋白组分析 | DSLB与细胞比例（1:8）、技术重复数（40）、每条件蛋白上样量（600 µg）、裂解液组成（Lysis Buffer 17含10 µg/mL Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A）、检测试剂盒（Proteome Profiler Human Phospho-Kinase Array Kit）。 阅读提示：Methods: Proteome profiler |
| BiTE杀伤实验 | 细胞与DSLB比例（1:10）、BiTE抗体浓度范围（0.1-100 pM）、T细胞与Panc-1细胞比例（1:2）、T细胞供体数（2）、共培养时间（12-48小时）、T细胞活化方法（Dynabeads CD3/CD28刺激3天+2天扩增）。 阅读提示：Methods: Bispecific T cell engager assays assay; T cell activation and expansion |
| 患者队列生存分析 | 数据来源（TCGA和GTEx）、样本量（176例肿瘤，252例正常）、归一化方法（DESeq2，均值缩放至1000）、统计方法（Cox比例风险回归，Kaplan-Meier）、多重检验校正（Benjamini-Hochberg FDR）、 cutoff值确定（25th-75th百分位间最低p值）。 阅读提示：Methods: Survival and differential expression analysis |