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        INSM1 调控驱动人干细胞模型中胶质母细胞瘤的神经元祖细胞状态

        INSM1 governs a neuronal progenitor state that drives glioblastoma in a human stem cell model.

        作者信息Patrick A DeSouza, Matthew Ishahak, Xuan Qu, Colin McCornack, Devi Annamalai, Diane D Mao, Rajanikanth Vangipurapu, Yiwei Fu, Alexandre T Vessoni, Ryan T Cleary, Rowland H Han, Punn Augsornworawat, Timothy Woodiwiss, Darby Agovino, Braxton Sizemore, Jessica Kline, Maryam Borhani-Haghighi, Hao Chen, Sangami Pugazenthi, Hiroko Yano, Ting Wang, Luis F Z Batista, Jeffrey R Millman, Albert H Kim
        PMID41354838
        期刊Nat Commun
        发布时间2025-12-07
        DOI10.1038/s41467-025-66371-x
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含同源基因编辑人NSC模型、体外功能实验、单细胞多组学、患者GBM scRNA-seq及原位异种移植功能验证

        主要模型

        同源基因编辑人胚胎干细胞来源的神经干细胞（WT、TERTp、TERTp+TP53、三突变PRO） 原位异种移植athymic nude小鼠脑肿瘤模型 原代胶质母细胞瘤干细胞样细胞（GSCs，包括B67等） 患者GBM单细胞RNA-seq数据（28例肿瘤及1例PDGFRA扩增肿瘤）

        重点核对

        四组基因型eNSC（WT、TERTp、TERTp+TP53、三突变PRO）各使用两个独立遗传克隆 原位注射约50,000个细胞至6周龄雌性athymic nude小鼠右侧壳核（坐标：前囟前1 mm、旁开2 mm、深2.5 mm） INSM1敲低使用两条独立RNAi序列（INSM1.1/INSM1i.2或GIPZ INSM1i.A/B），并设对照RNAi 体外功能检测包括极端有限稀释实验、软琼脂集落形成实验和Seahorse XF代谢分析 体内致瘤性通过MRI检测和Kaplan-Meier生存分析评估

        摘要

        胶质母细胞瘤是一种致死性脑癌，其特征是肿瘤细胞内在突变及其与发育程序相互作用所驱动的功能可塑性。为了研究经典胶质母细胞瘤突变如何促进功能可塑性，我们通过依次加入 TERT 启动子、TP53 和 PDGFRA 点突变，开发了一种同源人神经干细胞（NSC）胶质母细胞瘤模型。在连续诱变过程中，TP53 功能缺失增加 TERT 表达，但只有三突变 NSC 能在体内可靠地形成致死性脑肿瘤并重现胶质母细胞瘤。肿瘤细胞演化触发应激相关代谢变化，并向由转录因子 INSM1 驱动的神经元祖细胞网络转变。INSM1 在人胶质母细胞瘤肿瘤中高表达，并且在皮质发育过程中在产生神经元的中间祖细胞中高表达。值得注意的是，在三突变 NSC 和原代胶质母细胞瘤细胞中敲低 INSM1 会破坏致癌基因表达和功能，并抑制三突变 NSC 的体内致瘤性，突显了中间祖细胞样细胞状态在胶质母细胞瘤发病机制中的功能重要性。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        经典胶质母细胞瘤突变如何通过表观遗传驱动转录和细胞可塑性，促进恶性发育细胞状态和肿瘤发生？
        核心机制
        连续引入TERTp、TP53和PDGFRA突变驱动肿瘤细胞从应激相关代谢状态向由INSM1驱动的神经元祖细胞/中间祖细胞样网络转变；INSM1维持该致癌基因表达网络和代谢状态，从而促进肿瘤发生。
        主要证据
        同源人NSC模型显示仅三突变PRO eNSC在体外自我更新和克隆形成增强，并在小鼠脑内形成致死性肿瘤；单细胞转录组和染色质可及性分析揭示向INSM1驱动的神经元祖细胞状态演化；INSM1敲低逆转PRO eNSC转录组向WT样状态、降低糖酵解和自我更新，并抑制体内致瘤性、延长小鼠生存；患者GBM数据中INSM1在PRO亚型和NPC样状态高表达。
        研究意义
        建立了可重现患者肿瘤分子和细胞表型的同源人ESC来源PRO GBM模型，将GBM相关基因突变与致癌基因表达、发育状态和染色质调控因子直接联系，并提示INSM1作为GBM特异性候选靶点抑制肿瘤演化中的关键细胞命运转变。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        构建同源基因编辑人NSC模型

        在明确遗传背景下研究GBM突变的表观遗传和功能后果

        利用CRISPR/Cas9在H1 hESC中依次引入TERTp C228T、TP53 R248Q，并通过慢病毒转导PDGFRA D842V，获得WT、TERTp、TERTp+TP53和三突变PRO四组eNSC；通过Sanger测序、免疫印迹和标志物表达验证。

        2

        体外评估转化表型

        比较逐步添加突变对自我更新和克隆形成能力的影响

        对四组eNSC进行极端有限稀释实验和软琼脂集落形成实验。

        3

        体内致瘤性验证

        确定哪些基因型可在体内形成致死性脑肿瘤并重现GBM病理

        将四组eNSC原位植入athymic nude小鼠脑内，通过MRI监测肿瘤、记录生存，并进行组织学分析。

        4

        单细胞转录组解析体外演化轨迹

        揭示连续突变过程中转录状态和代谢程序的变化

        用HTO标记四组eNSC进行多重scRNA-seq，并采用CytoTRACE、RNA velocity（Dynamo/scVelo）、Monocle3和功能评分分析。

        5

        单细胞多组学解析染色质和转录因子活性

        识别PRO eNSC中调控发育命运的关键转录因子和染色质变化

        对WT和PRO eNSC进行10X Multiome ATAC+GEX测序，分析差异可及性和转录因子motif活性。

        6

        体内肿瘤单细胞转录组验证

        验证体外发现的演化轨迹是否在体内肿瘤中重现

        从原位PRO eNSC肿瘤中分选人核抗原+/CD45-细胞进行scRNA-seq，并进行轨迹和功能状态分析。

        7

        RNAi敲低INSM1、TCF4和SOX4并评估功能

        验证候选转录因子对PRO eNSC基因表达、代谢、自我更新和致瘤性的功能贡献

        用两条独立RNAi敲低INSM1、TCF4或SOX4，进行多重scRNA-seq、Seahorse代谢分析、极端有限稀释实验和体内原位移植。

        8

        患者GBM和正常皮质发育数据整合

        评估INSM1程序在人GBM和正常皮质祖细胞中的相关性

        分析TCGA GBM bulk RNA-seq、28例患者GBM scRNA-seq（24,131细胞）、1例PDGFRA扩增PRO GBM scRNA-seq（11,384细胞）以及人胚胎皮质祖细胞图谱（121,290细胞），进行INSM1签名评分和标签转移。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        Sanger测序下一代测序免疫荧光免疫印迹定量RT-PCR苏木精-伊红染色小动物MRI
        验证细胞功能变化
        极端有限稀释实验软琼脂集落形成实验Seahorse XF分析
        验证分子表达变化
        端粒重复扩增协议（TRAP）实验CUT&RUN结合qRT-PCR染色质免疫沉淀（ChIP）结合qRT-PCR
        验证机制链路
        RNA干扰（RNAi）慢病毒转导单细胞RNA测序（scRNA-seq）单细胞多组学ATAC+基因表达测序
        评估体内效果
        原位异种移植Kaplan-Meier生存分析
        数据分析与统计
        CytoTRACE分析RNA速度分析Monocle3伪时间分析基因本体富集分析基因集富集分析加权基因共表达网络分析（WGCNA）基于参考的标签转移Spearman相关分析主成分分析（PCA）

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养Matrigel hESC合格基质Corning8774552
        mTeSR1培养基Stemcell Technologies85850
        ROCK抑制剂ThermoFisherA2644501
        多聚-L-鸟氨酸Sigma-AldrichP2533
        层粘连蛋白Sigma-AldrichL2020
        含GlutaMAX的DMEM/F12Gibco11330-032
        D-葡萄糖Sigma-AldrichG8270
        胰岛素Sigma-AldrichSLBZ8936
        N-2添加剂Gibco17502-048
        B-27添加剂Gibco12587-010
        人表皮生长因子PeprotechAF-100-15
        小鼠成纤维细胞生长因子Peprotech100-18B
        TrypLE消化液Gibco12604-013
        神经干细胞分化敲除血清替代物Gibco10828028
        Noggin蛋白R&D Systems6057-NG
        SB431542StemCell Technologies72234
        LDN193189Reprocell04-0074
        免疫细胞化学正常驴血清Sigma-Aldrich39663
        Triton-XSigma-AldrichX100
        Oct-4抗体Cell Signaling Technology2750S
        Pax-6抗体Cell Signaling Technology60433S
        488 nm荧光基团偶联抗兔抗体Fisher ScientificA11034
        Hoechst 33258Fisher ScientificH3570
        转染聚乙烯亚胺（PEI）Polysciences24765-2
        OPTI-MEM培养基ThermoFisher31985062
        慢病毒生产Lenti-X浓缩试剂Clontech631231
        Lenti-X qRT-PCR滴定试剂盒Clontech631235
        免疫印迹蛋白酶抑制剂混合物Sigma-Aldrich539131
        Immobilon-P PVDF膜EMD MilliporeIPVH00010
        Pierce ECL免疫印迹底物Thermo Scientific32106
        PDGFRA抗体CST3174S
        磷酸化PDGFRA（Y754）抗体Abcamab5460
        磷酸化ERK（T202/4）抗体CST9101S
        磷酸化AKT（S473）抗体CST4060S
        TP53抗体CST9282
        β-ACTIN抗体Santa Cruzsc-47778
        软琼脂集落形成实验琼脂糖Lonza50101
        结晶紫溶液Sigma-AldrichC0775
        TERT表达qRT-PCRTaqMan检测试剂ThermoFisher4440040
        ACTIN TaqMan探针ThermoFisherHs99999903_m1
        GAPDH TaqMan探针ThermoFisherHs99999905_m1
        TERT TaqMan探针ThermoFisherHs00972650_m1
        TRAP实验Pierce蛋白酶抑制剂ThermoFisherA32955
        PhosSTOP磷酸酶抑制剂Roche04906837001
        RNase OUTInvitrogenP/N-51535
        Pierce BCA蛋白测定试剂盒ThermoFisher23225
        TRAPeze端粒酶检测试剂盒MilliporeS7700
        CUT&RUN伴刀豆球蛋白A磁珠Bang LaboratoriesBP531
        洋地黄皂苷Sigma-Aldrich300410
        抗三甲基化组蛋白H3赖氨酸4抗体Millipore05-745 R
        抗单甲基化组蛋白H3赖氨酸4抗体Abcamab8895
        抗三甲基化组蛋白H3赖氨酸9抗体Millipore07-442
        染色质免疫沉淀MyOne链霉亲和素T1磁珠ThermoFisher65601
        GABPα抗体Santa Cruzsc-28312
        GABPβ1抗体Proteintech12597-1-AP
        线粒体呼吸分析Seahorse细胞培养板Agilent101085-004
        Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒Agilent103015-100
        组织学人核抗原抗体Novus BiologicalsNBP2-34342
        荧光基团偶联抗小鼠二抗ThermoFisherA-21202
        Hoechst 33258Sigma94403
        Fluoromount-G封片剂Southern Biotech0100-01

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        同源基因编辑人NSC模型构建
        H1 hESC来源；TERTp C228T和TP53 R248Q突变序列；PDGFRA D842V慢病毒转导；每组两个独立遗传克隆；NSC标志物OCT4/PAX6验证
        阅读提示：Methods中Generation of genetically engineered hESC clones、Neural stem cell differentiation及Supplementary Fig. 1
        体外自我更新和克隆形成
        极端有限稀释接种密度（3000、600、120、24、5或1细胞/孔）和14天计数；软琼脂浓度0.3%/0.6%、7500细胞/孔和21天染色计数；每组重复数（WT/PRO n=4，TERTp/TERTp+TP53 n=3）
        阅读提示：Methods中Extreme limiting dilution analysis、Soft agar colony formation assay及Fig. 1E–G
        原位异种移植和体内致瘤性
        小鼠品系（CrTac:NCr-Foxn1nu）、周龄（6-8周）、性别（雌性）、注射细胞数（约50,000/只）、注射坐标（前囟前1 mm、旁开2 mm、深2.5 mm）、生存分析样本量（PRO n=12，其他n=10）
        阅读提示：Methods中Xenotransplantation及Fig. 1H–K
        INSM1敲低体内实验
        两条独立INSM1 RNAi序列、对照RNAi、PRO克隆1和克隆2的动物数（n=10和n=5）、MRI检测时间点（移植后200天）和生存终点
        阅读提示：Methods中Lentiviral RNAi transduction、Xenotransplantation及Fig. 6E, F
        单细胞转录组和代谢分析
        scRNA-seq细胞数和质量控制阈值；Seahorse XF分析细胞接种密度（6×10^4/孔）、药物浓度（oligomycin 3 µM、FCCP 0.25 µM、rotenone 1 µM、antimycin A 2 µM）及重复数
        阅读提示：Methods中Multiplexed sequencing analysis workflow、Mitochondrial respiration studies及Fig. 3C、Fig. 5H, I

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