构建等基因突变hiPSC系
在GATA2缺陷背景下引入SETBP1和ASXL1突变，模拟患者突变轨迹。
用CRISPR/Cas9和ssODN在亲本hiPSC中引入SETBP1 D868N（GoF）和ASXL1 G646Wfs*12（LoF）杂合突变，结合已有GATA2 R396Q突变，获得单、双、三突变克隆，并通过PCR、RFLP和Sanger测序鉴定。
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基于人iPSC的建模揭示SETBP1是GATA2缺陷中染色质重塑的驱动因素
Human iPSCs-based modeling unveils SETBP1 as a driver of chromatin rewiring in GATA2 deficiency.
实验完整度
高包含hiPSC体外造血分化、CRISPR/Cas9基因编辑、bulk ATAC-seq、RNA-seq、scATAC-seq及功能验证（集落形成、细胞周期/凋亡）。
主要模型
人iPSC来源的造血祖细胞（CD34+CD43+CD33+CD45+） 亲本及GATA2、SETBP1、ASXL1单/双/三突变hiPSC系 胚胎体（EB）体外髓系分化体系
重点核对
hiPSC系：亲本CBI08#4及GATA2 R396Q、SETBP1 D868N、ASXL1 G646Wfs*12单/双/三突变克隆，每条件2个独立克隆 EB分化第15天流式检测CD34+CD43+、CD34+CD45+、CD33+CD11b+、CD14+、CD15+细胞比例 ATAC-seq和RNA-seq使用分选的CD34+CD43+CD33+CD45+细胞，差异阈值|log2FC|>0.5且padj<0.05 集落形成实验每孔接种21,000个细胞，培养14天计数CFU-G、CFU-M、CFU-GM 细胞周期EdU掺入10 µM处理7小时，凋亡用Annexin V检测
摘要
GATA2缺陷患者易患骨髓增生异常肿瘤（MDS），并可进展为急性髓系白血病。这种进展常与细胞遗传学和体细胞改变相关。在GATA2患者中反复观察到SETBP1和ASXL1基因突变，但其作用仍知之甚少。在这里，我们开发了一个基于hiPSC的系统来研究SETBP1和ASXL1突变在GATA2缺陷中的影响。利用精确基因组编辑，我们重现了在GATA2相关MDS中观察到的逐步突变轨迹。我们证明GATA2突变对造血祖细胞影响有限，而SETBP1或ASXL1突变的共现会损害髓系分化。三种突变的组合严重耗竭髓系祖细胞，重现了GATA2相关MDS并突显了它们的协同相互作用。值得注意的是，SETBP1突变在建立稳定的染色质可及性景观中起主导作用，即使与ASXL1共现时也是如此。我们的研究建立了一个基于iPSC的GATA2缺陷模型，为髓系疾病进展提供了新见解，并为测试未来治疗策略提供了一个平台。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SETBP1和ASXL1突变在GATA2缺陷相关的髓系转化和MDS进展中起什么作用？
- 核心机制
- 在GATA2缺陷背景下，SETBP1突变驱动稳定的染色质可及性重塑，上调白血病干细胞相关基因并下调髓系分化基因；ASXL1突变诱导的染色质变化多为短暂性，两者协同损害髓系分化。
- 主要证据
- hiPSC体外髓系分化显示GATA2单突变影响有限，SETBP1或ASXL1共突变损害髓系分化，三突变严重耗竭髓系祖细胞；ATAC-seq和RNA-seq显示SETBP1突变建立的染色质开放景观在GSA中大部分保留，而ASXL1诱导的变化在GSA中大量丢失。
- 研究意义
- 建立了首个可研究GATA2缺陷中获得性致癌突变功能影响的人源iPSC模型，为研究GATA2相关MDS进展机制和测试未来治疗策略提供了平台。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外髓系分化及造血表型分析
评估各突变组合对造血祖细胞和髓系分化的影响。
通过EB-based protocol诱导中胚层、生血内皮祖细胞和造血祖细胞，第15天用流式细胞术检测CD34+CD43+、CD34+CD45+、CD33+CD11b+、CD14+、CD15+细胞，并进行集落形成实验、细胞周期和凋亡分析。
染色质可及性分析（bulk ATAC-seq）
解析各突变对染色质景观的影响，确定SETBP1和ASXL1的作用。
分选第15天CD34+CD43+CD33+CD45+细胞进行bulk ATAC-seq，分析差异可及峰、PCA、热图、GSEA和转录因子motif富集。
转录组分析（bulk RNA-seq）
鉴定各突变阶段的差异表达基因，验证与染色质变化的关联。
分选200个CD34+CD43+CD33+CD45+DAPI-细胞，Smart-seq2扩增cDNA，Nextera Low-Input建库，HiSeq2000测序，DESeq2分析差异表达基因。
单细胞染色质可及性验证（scATAC-seq）
确认染色质差异非细胞异质性所致，验证bulk ATAC-seq结果。
使用SHARE-seq对P、G、GA、GS、GSA条件分选的CD34+CD33+CD43+CD45+细胞进行单细胞ATAC-seq，经质控后分析，并与bulk数据伪bulk整合验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| hiPSCs培养 | 基质胶 | Cultek S.L. | 356231 |
| mTeSR1培养基 | StemCell Technologies | 85850 | |
| hiPSCs传代 | 磷酸盐缓冲液 | Fisher Scientific | 10204733 |
| CRISPR/Cas9基因编辑 | Alt-R S.p. Cas9蛋白 | IDT | -- |
| Alt-R CRISPR-Cas9 sgRNA | IDT | -- | |
| Accutase细胞解离液 | Gibco | -- | |
| 4D-Nucleofector系统 | Lonza | -- | |
| RFLP分析 | AvaI限制酶 | -- | -- |
| BseRI限制酶 | -- | -- | |
| SYBR-safe核酸染料 | Invitrogen | S33102 | |
| 核型分析 | KaryoMax秋水仙胺 | Invitrogen | 15212012 |
| DNA提取 | QIAamp DNA迷你试剂盒 | QIAGEN | M7806 |
| PCR | GoTaq Flexi DNA聚合酶 | Promega | M7806 |
| PCR产物纯化 | DNA Clean & Concentrator-5纯化试剂盒 | Zymo Research | D4003 |
| 流式分析 | 胶原酶B | Roche | 11088807001 |
| 人血清白蛋白 | Vitrolife | 10064 | |
| Annexin V缓冲液 | Immunostep | ANXVF-200T | |
| Gallios流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| CD34-PE抗体（克隆8G12） | Miltenyi Biotec S.L. | 130046702 | |
| CD43-APC抗体（克隆1G10） | Becton Dickinson | 560198 | |
| CD45-APC-H7抗体（克隆2D1） | Becton Dickinson | 560178 | |
| CD33-APC抗体（克隆WM53） | Becton Dickinson | 551378 | |
| CD11b-PE-Cy7抗体（克隆ICRF44） | Becton Dickinson | 557743 | |
| CD14-BV421抗体（克隆MPHIP9） | Becton Dickinson | 563743 | |
| CD15-PE抗体（克隆HI98） | Becton Dickinson | 555402 | |
| Annexin V-FITC | Immunostep | ANXVF-200T | |
| FACS分选 | CD34-FITC抗体（克隆8G12） | Becton Dickinson | 348053 |
| CD33-BV510抗体（克隆WM53） | Becton Dickinson | 563257 | |
| 碘化丙啶 | Sigma | P4170-100MG | |
| MoFlo Astrios EQ细胞分选仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 集落形成实验 | MethoCult甲基纤维素培养基 | Stemcell Technologies | H4434 |
| 细胞周期分析 | Click-iT Plus EdU细胞增殖试剂盒 | Invitrogen | C10425 |
| bulk ATAC-seq | Tn5转座酶 | Diagenode | C01070012 |
| 2×转座缓冲液 | Diagenode | C01019043 | |
| 蛋白酶K | ThermoScientific | EO0491 | |
| SPRI磁珠 | Beckman Coulter | A63880 | |
| NEBNext高保真2×PCR预混液 | NEB | M0541 | |
| Qubit dsDNA BR检测试剂盒 | Invitrogen | Q32850 | |
| scATAC-seq | NxGen RNase抑制剂 | Biosearch Technologies | 30281-2 |
| SUPERase RNase抑制剂 | Thermo Fisher Invitrogen | AM2696 | |
| 16%甲醛 | Thermo Fischer Pierce | 28906 | |
| Tn5转座酶（未加载） | Diagenode | C01070010-20 | |
| 转座酶稀释缓冲液 | Diagenode | C01070011 | |
| 无核酸酶水 | Thermo Fischer Invitrogen | AM9938 | |
| AMPure磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| 洗脱缓冲液 | QIAGEN | 19086 | |
| 高灵敏度D5000试剂盒 | Agilent | 5067-5593 | |
| Screen Tape | Agilent | 5067-5592 | |
| NEBNext Illumina文库定量试剂盒 | New England Biosciences | E7630L | |
| NovaSeq 6000 S1 1.5v试剂盒（200循环） | Illumina | 20028318 | |
| bulk RNA-seq | RNase抑制剂 | Thermo Scientific | EO038SKB011 |
| Agilent高灵敏度DNA芯片 | Agilent | -- | |
| Nextera低起始量建库试剂盒 | -- | -- | |
| HiSeq2000测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| hiPSC系构建与鉴定 | 亲本细胞系CBI08#4；GATA2 R396Q、SETBP1 D868N、ASXL1 G646Wfs*12突变类型及杂合性；每条件2个独立克隆；核型和多能性标记物 阅读提示：Methods 'hiPSCs culture and hematopoietic differentiation'、'CRISPR/Cas9 gene editing'及Supplementary Fig. 1 |
| 体外EB髓系分化 | EB分化d0-d2使用mTeSR1 + 50 ng/ml BMP4；d3起使用StemPro-34培养基添加0.16 mM monothioglycerol、15.15 mg/mL holotransferrin、50 ng/mL BMP-4、300 ng/mL Flt-3L、300 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3、10 ng/mL IL-6；分化至第15天，每3天换液 阅读提示：Methods 'hiPSCs culture and hematopoietic differentiation'及Supplementary Fig. 1D |
| 流式细胞术表型分析 | 第15天检测CD34+CD43+、CD34+CD45+、CD33+CD11b+、CD14+、CD15+；各条件生物学重复数（P=32/29/29/21/18/18等，S=7/7/7/6/6/6，A=6，G=26/23/23/17/17/16，GS=26/23/23/17/17/17，GA=13/13/13/9/9/9，GSA=26/23/23/17/17/17） 阅读提示：Fig. 1B–H及图注 |
| 集落形成实验 | 每孔接种21,000个细胞于MethoCult，培养14天；计数CFU-G、CFU-M、CFU-GM；各条件独立生物学实验数（P=10，S=4，A=4，G=8，GS=8，GA=4，GSA=8） 阅读提示：Methods 'Clonogenic assay'及Fig. 1I图注 |
| bulk ATAC-seq | 分选CD34+CD43+CD33+CD45+细胞数（P/S/A/G≥50,000，GS 28,000，GA 25,000，GSA 8,000）；Tn5转座37°C 50分钟；测序100-150 bp paired-end约70M reads；差异阈值padj<0.05且|log2FC|>0.5 阅读提示：Methods 'Bulk ATAC-seq of hiPSCs'和'Bulk ATAC-seq analysis' |
| bulk RNA-seq | 分选200个CD34+CD43+CD33+CD45+DAPI-细胞；Smart-seq2全长cDNA扩增；Nextera Low-Input建库；HiSeq2000测序；DESeq2差异分析阈值padj<0.05且|log2FC|>0.5 阅读提示：Methods 'Bulk RNA sequencing of hiPSCs'和'Genome-wide gene expression analysis' |
| scATAC-seq | 分选CD34+CD33+CD43+CD45+细胞数（P 32,000-40,000，G 27,000-31,000，GS 16,000-28,000，GA 7,000-28,000，GSA 8,000）；SHARE-seq每个转座反应10,000细胞；NovaSeq 6000测序；保留>1000 alignments的细胞 阅读提示：Methods 'Single-cell ATAC-seq processing' |
| 细胞周期与凋亡分析 | 第15天EB用10 µM EdU处理7小时；CD33-APC染色；Click-iT Plus EdU试剂盒检测；Annexin V-FITC检测凋亡 阅读提示：Methods 'Cell cycle assay'和'Flow cytometry analysis'及Fig. 1J、Supplementary Fig. 1E |