SOX10缺失上调YAP1/TAZ-TEAD信号
验证SOX10缺失是否足以上调TEAD靶基因及YAP1/TAZ信号
对A375和MeWo SOX10敲除细胞与亲本细胞进行RNA-seq和GSEA分析，Western blot检测CTGF、CYR61等蛋白表达；分析公共ATAC-seq和scRNA-seq数据。
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在微小残留病灶中靶向TAZ-TEAD可延长黑色素瘤模型靶向治疗的持续时间
Targeting TAZ-TEAD in minimal residual disease enhances the duration of targeted therapy in melanoma models.
实验完整度
高包含体外细胞系、3D球体、体内异种移植模型及多种分子验证，具备功能与机制验证。
主要模型
A375黑色素瘤细胞系（BRAF V600E） MeWo黑色素瘤细胞系（BRAF野生型） WM983B黑色素瘤细胞系 A375及YUMM1.7异种移植小鼠模型
重点核对
细胞模型：A375、MeWo及其SOX10敲除克隆，WM983B，CRT34/35，PBRT15/16 药物处理：PLX4720（1 μM）和PD-0325901（35 nM）用于体外；PLX4720（200 PPM）和PD-0325901（7 PPM）用于体内 TEAD抑制剂：OPN-9643和OPN-9652体外常用2 μM，体内50 mg/kg口服灌胃每周两次 siRNA敲低：YAP1、TAZ、TEAD1、TEAD4，终浓度25 nM，处理72小时 体内模型：A375异种移植，MRD后随机分组，每组6-7只小鼠
摘要
癌症靶向治疗受到药物耐受细胞的限制。我们旨在靶向药物耐受以延缓获得性耐药的发生。在黑色素瘤中，对MAPK通路抑制剂的耐受与SOX10缺失及TEAD转录程序增强相关。我们发现SOX10缺失足以上调TEAD靶基因，且依赖于共激活因子TAZ。活性TAZ足以介导对BRAF抑制剂和MEK抑制剂的耐受。我们开发了两种共价抑制剂OPN-9643和OPN-9652，设计用于靶向TEADs的中央棕榈酸结合口袋。在SOX10缺陷细胞中，OPN-9643和OPN-9652降低TEAD依赖性报告基因活性及TEAD靶基因CTGF和CYR61的表达。在SOX10敲除细胞的2D和3D生长实验中，OPN-9643和OPN-9652处理增强了MAPK靶向治疗的抑制效果，并逆转了活性TAZ介导的耐受。在体内，OPN-9652从微小残留病灶阶段延缓了对BRAF抑制剂和MEK抑制剂的获得性耐药的发生。因此，TAZ-TEAD活性在黑色素瘤药物耐受和获得性耐药发展中发挥重要作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过靶向黑色素瘤中对BRAFi/MEKi耐受的细胞来延缓获得性耐药的发生？
- 核心机制
- SOX10缺失上调TEAD转录程序，该过程高度依赖TAZ；活性TAZ足以介导对BRAFi和MEKi的耐受，且该耐受依赖于TEAD。
- 主要证据
- 在SOX10敲除的A375和MeWo细胞中，TAZ敲低显著降低CTGF和CYR61表达并重新敏化细胞对BRAFi+MEKi；TAZ-S89A表达足以诱导耐受；TEAD抑制剂OPN-9643和OPN-9652降低TEAD报告基因活性及靶基因表达，并在2D、3D及体内模型中增强MAPK靶向治疗效果，延缓耐药。
- 研究意义
- 研究提示靶向TAZ-TEAD可作为一种策略，在微小残留病灶阶段消除药物耐受持久细胞，从而增强现有靶向治疗的持久性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定TAZ是TEAD靶基因的主要调控因子
比较YAP1和TAZ在SOX10缺陷细胞中对TEAD转录程序的贡献
siRNA敲低YAP1或TAZ，RNA-seq及GSEA分析，Western blot检测CTGF/CYR61；构建YAP1/TAZ基因签名。
验证活性TAZ足以诱导药物耐受
测试TAZ-S89A表达是否足以在药物敏感细胞中诱导对BRAFi+MEKi的耐受
构建多西环素诱导的TAZ-S89A、YAP1-S127A和LacZ细胞，在BRAFi+MEKi存在下进行IncuCyte生长实验。
验证TAZ介导的耐受依赖于TEAD
确定TAZ诱导的耐受是否通过TEAD起作用
在TAZ-S89A诱导细胞中敲低TEAD1-4或诱导TEAD1-Y421E突变体，检测CTGF/CYR61表达和细胞生长。
开发并表征TEAD抑制剂
合成靶向TEAD棕榈酸结合口袋的共价抑制剂并验证其活性
合成OPN-9643和OPN-9652，在NCI-H226细胞中测定生长IC50，在MSTO-211H细胞中测定TEAD报告基因IC50，进行蛋白质热稳定实验和共晶结构解析。
验证TEAD抑制剂降低TEAD靶基因表达
检测OPN-9643和OPN-9652对TEAD驱动转录的影响
用2 μM OPN-9643或OPN-9652处理SOX10敲除细胞24-48小时，进行荧光素酶报告基因实验、Western blot、RPPA和RNA-seq。
验证TEAD抑制剂增强MAPK靶向治疗效果
测试OPN-9643/OPN-9652是否重新敏化SOX10敲除细胞对BRAFi+MEKi
在2D IncuCyte和3D球体模型中，联合使用TEAD抑制剂与BRAFi+MEKi，检测细胞生长和死亡。
体内验证TEAD抑制剂延缓获得性耐药
在微小残留病灶模型中测试OPN-9652能否延缓耐药发生
建立A375和YUMM1.7异种移植模型，经BRAFi+MEKi治疗达到MRD后，随机分组给予OPN-9652联合治疗，监测肿瘤生长和生存。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| MCDB153培养基 | Sigma | -- | |
| Leibowitz L-15培养基 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 支原体检测 | MycoScope试剂盒 | Genlantis | -- |
| Western blot | Laemmli上样缓冲液 | -- | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| HRP标记二抗 | CalBioTech | -- | |
| 化学发光HRP底物 | ThermoScientific | -- | |
| SOX10抗体 | Cell Signaling Technology | 89356 | |
| CTGF抗体 | Cell Signaling Technology | 86641 | |
| CYR61抗体 | Cell Signaling Technology | 14479S | |
| HSP90抗体 | Cell Signaling Technology | 4877 | |
| Merlin抗体 | Cell Signaling Technology | 12888 | |
| TAZ抗体 | Cell Signaling Technology | 70148S | |
| HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2367 | |
| TEAD1抗体 | Cell Signaling Technology | 12292S | |
| 磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9101 | |
| 总ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| pan-TEAD抗体 | Cell Signaling Technology | 13295S | |
| FOXM1抗体 | Cell Signaling Technology | 5436 | |
| PAI-1抗体 | Cell Signaling Technology | 49536 | |
| 磷酸化c-Met抗体 | Cell Signaling Technology | 3077 | |
| c-Met抗体 | Cell Signaling Technology | 8198 | |
| PLK1抗体 | Cell Signaling Technology | 4513S | |
| RAD51抗体 | Cell Signaling Technology | 8875 | |
| AXL抗体 | Cell Signaling Technology | 8661 | |
| β-半乳糖苷酶抗体 | Promega | Z378A | |
| YAP1抗体 | Abcam | ab52771 | |
| TEAD4抗体 | Abcam | ab58310 | |
| 肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | A2066 | |
| 山羊抗小鼠IgG | Sigma-Aldrich Co. | 401215 | |
| 山羊抗兔IgG | Sigma-Aldrich Co. | 401315 | |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| YAP1 siRNA | Dharmacon | D-012200-01, D-012200-02 | |
| WWTR1 siRNA | Dharmacon | D-016083-01, D-016083-02 | |
| TEAD1 siRNA | Dharmacon | J-012603-05 | |
| TEAD4 siRNA | Dharmacon | J-019570-08 | |
| 慢病毒构建 | pLentipuro/TO/V5-DEST载体 | -- | -- |
| NEBuilder HiFi组装克隆试剂盒 | -- | E5520S | |
| pVADE2骨架 | -- | -- | |
| pLP1、pLP2、pLP/VSVG包装质粒 | -- | -- | |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 基因诱导 | 多西环素 | -- | -- |
| 细胞活力检测 | CellTiter Glo试剂 | Promega | -- |
| 药物处理 | PD-0325901 | Selleck Chemicals | -- |
| VT106 | Vivace Therapeutics | -- | |
| VT107 | Vivace Therapeutics | -- | |
| 荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| 被动裂解缓冲液 | Promega | -- | |
| ONE-Glo试剂 | Promega | -- | |
| CellTiter-Fluor试剂 | Promega | -- | |
| 蛋白质热稳定实验 | GloMelt Biotium染料 | Biotium | -- |
| 蛋白质纯化 | Ni-NTA树脂 | Lifetech | -- |
| Superdex 200 26/60色谱柱 | Cytiva Life Sciences | -- | |
| HiPrep 26/10脱盐柱 | Cytiva Life Sciences | -- | |
| 3D球体培养 | 钙黄绿素-AM | Invitrogen | C1430 |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| 大鼠尾I型胶原蛋白 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞模型与培养 | 细胞系来源（A375、MeWo、WM983B）、SOX10敲除克隆编号、培养基成分（DMEM+10% FBS+1% P/S；WM983B用MCDB153+2% FBS+20% L-15+5 μg/ml胰岛素）、传代及支原体检测 阅读提示：Methods 'Cell culture'小节 |
| 药物处理与生长实验 | BRAFi（PLX4720 1 μM）和MEKi（PD-0325901 35 nM）浓度；TEAD抑制剂（OPN-9643/OPN-9652 2 μM）浓度；处理持续时间及更新频率（每48-72小时）；IncuCyte成像分析参数 阅读提示：Methods 'Cell growth assay'及Figure legends 4、7 |
| 基因敲低实验 | siRNA序列（YAP1、WWTR1、TEAD1、TEAD4）、终浓度25 nM、转染试剂Lipofectamine RNAiMAX、敲低持续时间72小时 阅读提示：Methods 'Small interfering RNA (siRNA) transfection' |
| 诱导表达实验 | 多西环素浓度（100 ng/mL）、诱导时间（48小时）、构建体（TAZ-S89A、YAP1-S127A、LacZ、TEAD1-Y421E） 阅读提示：Methods 'Lentiviral constructs'及Figure legends 3、4 |
| 体内药效实验 | 小鼠品系（NSG）、肿瘤细胞接种数量（文中未明确说明）、给药剂量（OPN-9652 50 mg/kg，口服灌胃，每周两次）、BRAFi+MEKi饲料浓度（PLX4720 200 PPM + PD-0325901 7 PPM）、随机分组方法、样本量（A375模型每组6-7只，YUMM1.7模型每组4-5只） 阅读提示：Methods 'In vivo studies'及Figure legend 8 |