建立PWS患者iPSC模型
获得携带PWS印记缺陷的人类细胞模型
使用4例PWS患者来源的iPSCs（缺失型2PWS8和5PWS10、mUPD型3PWS14、印记缺陷型4PWS1）及3例健康对照iPSC系（201B7、TIG119、WD39），在StemFit AK02培养基中维持培养。
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通过表观基因组编辑在Prader-Willi综合征人类细胞模型中挽救印记基因
Rescue of imprinted genes by epigenome editing in human cellular models of Prader-Willi syndrome.
实验完整度
高包含患者iPSC、下丘脑类器官及单细胞转录组等多层证据，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
PWS患者来源的iPSCs 健康对照iPSC系（201B7、TIG119、WD39） 下丘脑类器官
重点核对
iPSC系来源：4例PWS患者（缺失型2PWS8和5PWS10、mUPD型3PWS14、印记缺陷型4PWS1）及3例健康对照（201B7、TIG119、WD39） 表观编辑系统：CRISPR/dCas9-Suntag-TET1，5条靶向PWS-ICR的gRNA，慢病毒MOI约10，脂质体转染1.0 μg dCas9-GCN4s和1.0 μg scFv-sfGFP-TET1CD质粒 下丘脑类器官分化：第0天每孔20,000个iPSCs聚集，第6–15天2 μM SAG处理，第21天后40%氧气浓度，第51天起20% KSR 检测时间点：iPSCs阶段RT-qPCR和甲基化分析，类器官第30、60、100天分析 单细胞RNA测序：类器官分化第63–66天，10,000细胞上机，质控后gRNA(−) 7918细胞和gRNA(+) 8786细胞
摘要
Prader-Willi综合征（PWS）是一种基因组印记疾病，由父源染色体15q11-13功能丧失引起，导致与下丘脑功能障碍相关的系列症状。PWS患者缺乏15q11-13位点父源表达基因（PEGs）的表达，但母源等位基因上拥有一组表观遗传沉默的此类基因。因此，激活这些沉默基因可作为PWS的治疗靶点。在此，我们利用基于CRISPR的表观基因组编辑系统，调节源自PWS患者的诱导多能干细胞（iPSCs）中PWS印记控制区（PWS-ICR）的DNA甲基化状态。PWS-ICR的成功去甲基化恢复了母源等位基因上PEG的表达，并重组了PWS-ICR之外其他PWS相关印记区域的甲基化模式。值得注意的是，这些校正的表观基因组模式和PEG表达在这些细胞分化为下丘脑类器官后得以维持。最后，对表观基因组编辑类器官的单细胞转录组分析表明，PWS中观察到的转录组失调得到部分恢复。本研究强调了表观基因组编辑技术作为解决PWS及其他潜在印记疾病治疗方法的效用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否利用CRISPR表观基因组编辑靶向PWS-ICR，重新激活PWS患者细胞中母源等位基因上沉默的印记基因？
- 核心机制
- PWS-ICR去甲基化直接激活SNRPN等基因表达，并触发邻近印记区域（如MAGEL2）的继发性去甲基化，从而恢复部分父源表达基因的表达。
- 主要证据
- 在PWS患者iPSCs中，表观编辑使PWS-ICR去甲基化并恢复SNRPN、SNORD116、IPW和MAGEL2表达，但NDN未恢复；编辑后的iPSCs分化为下丘脑类器官后，印记基因表达和去甲基化模式得以维持；单细胞转录组分析显示编辑类器官部分逆转PWS相关转录组失调；钙成像显示编辑类器官神经元活性恢复至对照水平。
- 研究意义
- 本研究为CRISPR介导的表观基因组编辑治疗PWS提供了原理验证，并提示该策略可能适用于其他印记疾病。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CRISPR表观基因组编辑靶向PWS-ICR
验证能否通过去甲基化PWS-ICR恢复PEG表达
将5条靶向PWS-ICR的gRNA通过慢病毒感染iPSCs，随后脂质体转染dCas9-Suntag-TET1组分（dCas9-GCN4s和scFv-sfGFP-TET1CD），筛选单细胞克隆，检测SNRPN表达和PWS-ICR甲基化。
评估脱靶效应
确认表观编辑是否引起脱靶甲基化或表达改变
通过CRISPRdirect预测潜在脱靶位点，利用全基因组纳米孔测序、甲基化qPCR和bulk RNA测序分析脱靶位点的甲基化和基因表达。
分析其他印记基因的表达和甲基化变化
确定PWS-ICR编辑对15q11-13其他印记基因的影响
检测SNORD116、IPW、MAGEL2、NDN等基因表达，并通过纳米孔长读长测序和甲基化qPCR分析其启动子甲基化状态。
下丘脑类器官分化及维持效应评估
验证表观编辑效应能否在分化为下丘脑类器官后维持
将编辑后的2PWS8 iPSCs通过SFEBq法分化为下丘脑类器官，在分化第30、60、100天检测下丘脑标志物、PEG表达和DNA甲基化。
单细胞转录组分析
全面表征表观编辑类器官的转录组变化
对分化第63–66天的下丘脑类器官进行scRNA-seq，比较gRNA(+)和gRNA(−)类器官的细胞类型组成和基因表达，并进行GSEA和RRHO2分析。
钙成像评估神经元活动
验证表观编辑是否恢复PWS类器官的神经元功能
用编码jGCaMP8s的慢病毒感染下丘脑类器官，在d100–121进行钙成像，分析自发活动频率。
在分化中的类器官直接进行表观编辑
探索在类器官中直接编辑PWS-ICR的可行性
将gRNAs-mCherry慢病毒和dCas9-Suntag-TET1组分通过慢病毒和脂质体分别递送至PWS iPSC来源的类器官，检测SNRPN表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | StemFit AK02培养基 | Ajinomoto | -- |
| iMatrix包被板 | -- | -- | |
| StemScale多能干细胞悬浮培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 质粒构建 | pPlatTET-gRNA2质粒 | Addgene | #82559 |
| 慢病毒生产 | 聚乙烯亚胺 | -- | -- |
| 高糖DMEM | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 胎牛血清 | Sigma Aldrich | -- | |
| 青霉素/链霉素溶液 | Nacalai Tesque | -- | |
| 佛司可林 | Wako | -- | |
| 慢病毒浓缩 | Amicon ultra 100 K 0.5 mL过滤器 | Millipore | -- |
| 基因转染 | Lipofectamine Stem试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Opti-MEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Y-27632 | -- | -- | |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | QIAGEN | -- |
| 逆转录 | ReveTra Ace qPCR RT预混液 | Toyobo | -- |
| RT-qPCR | TB Green Premix ExTaq II | TaKaRa Bio | -- |
| ViiA 7实时PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| DNA提取 | DNeasy血液与组织试剂盒 | Qiagen | -- |
| 甲基化qPCR | EpiScope甲基化和非甲基化HCT116 gDNA | TaKaRa Bio | -- |
| HpaII限制性内切酶 | New England BioLabs | -- | |
| MseI限制性内切酶 | New England BioLabs | -- | |
| MspI限制性内切酶 | New England BioLabs | -- | |
| AluI限制性内切酶 | New England BioLabs | -- | |
| HinP1I限制性内切酶 | New England BioLabs | -- | |
| HpyCH4IV限制性内切酶 | New England BioLabs | -- | |
| TB Green Premix Ex Taq GC | TaKaRa Bio | -- | |
| 亚硫酸氢盐测序 | EZ DNA甲基化金牌试剂盒 | Zymo | -- |
| EpiTaq HS | TaKaRa Bio | -- | |
| pCR2.1-TOPO载体 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 纳米孔测序 | GridION测序仪 | ONT | -- |
| Sanger测序 | Primer Star MAX | Takara Bio | -- |
| QIAquick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 短串联重复序列分析 | Promega Gene Print 10系统 | Promega | -- |
| bulk RNA测序 | TruSeq链特异性总RNA with Ribo Zero Plus | Illumina | -- |
| NovaSeqX测序仪 | Illumina | -- | |
| 下丘脑类器官分化 | TrypLE Select | -- | -- |
| 低吸附96孔V底锥形孔板 | Sumitomo Bakelite | -- | |
| IMEM + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| F-12 + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Wako | -- | |
| CDLC | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 1-硫代甘油 | Sigma Aldrich | -- | |
| KnockOut血清替代物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Smoothened激动剂 | Cayman Chemical | -- | |
| EZ球状培养皿 | IWAKI | -- | |
| 免疫组织化学 | OCT包埋剂 | Sakura | -- |
| 抗原修复液 | Dako | -- | |
| RAX抗体（豚鼠） | TaKaRa Bio | M229 | |
| NKX2-1抗体（小鼠） | Thermo Fisher Scientific | MA5-13961 | |
| OTP抗体（兔） | GeneTex | GTX119601 | |
| Alexa Fluor 488 | Life Technologies | -- | |
| Alexa Fluor 555 | Life Technologies | -- | |
| Alexa Fluor 647 | Life Technologies | -- | |
| Hoechst33342 | Dojindo Laboratories | -- | |
| PermaFluor水性封片剂 | Epredia | -- | |
| LSM-710共聚焦激光扫描显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| 单细胞RNA测序 | 木瓜蛋白酶解离系统试剂盒 | Worthington Biochemical | -- |
| 牛血清白蛋白 | Miltenyi Biotec | -- | |
| Chromium单细胞3′芯片 | 10x Genomics | -- | |
| Chromium单细胞3′文库与凝胶珠试剂盒v3 | 10x Genomics | -- | |
| DNBSEQ测序仪 | BGI | -- | |
| 钙成像 | jGCaMP8s慢病毒 | VectorBuilder | -- |
| BrainPhys神经元培养基 | Stemcell Technologies | -- | |
| B-27添加剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 玻璃底12孔培养皿 | Cellvis | -- | |
| LSM-980共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| iPSC培养与表观编辑 | iPSC系来源及代数、gRNA序列、慢病毒感染MOI、转染质粒量、转染试剂用量、单细胞克隆筛选标准 阅读提示：Methods中Human stem cell culture、Gene transfection及Supplementary Fig. 1、Supplementary Table 1 |
| PWS-ICR甲基化检测 | 甲基化qPCR所用酶组合（HpaII+MseI、MspI+MseI）、消化时间温度、标准曲线方程、亚硫酸氢盐测序引物及克隆数 阅读提示：Methods中Methylation qPCR、Bisulfite sequencing及Supplementary Fig. 3e |
| 下丘脑类器官分化 | 起始细胞数、SAG浓度及处理时间窗、氧气浓度切换时间点、培养基更换频率、分析时间点 阅读提示：Methods中Hypothalamic organoid generation及Fig. 2b |
| 单细胞RNA测序 | 类器官分化天数、细胞上机数、质控阈值（基因数、UMI、线粒体比例）、整合分析方法 阅读提示：Methods中Single-cell RNA sequencing |
| 钙成像 | 成像时间窗、病毒血清型及滴度、活动事件检测阈值（MAD倍数、最小ΔF/F0） 阅读提示：Methods中Calcium imaging及Supplementary Fig. 11 |