TGF-β诱导一碳代谢酶表达的验证
确定TGF-β是否调控线粒体一碳代谢途径酶的表达及其信号通路。
用TGF-β处理人肺成纤维细胞，检测MTHFD2、ALDH1L2、MTHFD1L的mRNA和蛋白表达；通过siRNA敲低ATF4及使用mTORC1抑制剂Rapalink-1和TORIN1验证信号通路。
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线粒体一碳代谢是TGF-β诱导的甘氨酸合成及纤维化反应所必需的
Mitochondrial one-carbon metabolism is required for TGF-β-induced glycine synthesis and fibrotic responses.
实验完整度
高含人肺成纤维细胞体外模型、代谢示踪、基因敲低、药理学抑制、小鼠博来霉素模型及患者scRNAseq和免疫组化等多层证据。
主要模型
人肺成纤维细胞（正常供体及IPF患者来源） C57Bl/6J小鼠博来霉素诱导肺纤维化模型 IPF患者肺组织样本 公开单细胞RNAseq数据（小鼠及人肺成纤维细胞）
重点核对
TGF-β处理浓度1 ng/mL及处理时间（24小时或48小时等指征时间） MTHFD2 siRNA转染（250 pmol，Amaxa Nucleofector 2b程序A-024） DS18561882浓度5 μM（体外）及100 mg/kg腹腔注射（体内） 博来霉素剂量：单次0.7 U/kg，多次0.5 U/kg，气管内滴注 代谢示踪剂：400 μM 13C2-甘氨酸、2,3,3-D3-L-丝氨酸或13C3-L-丝氨酸
摘要
TGF-β依赖性的肺成纤维细胞活化是特发性肺纤维化（IPF）的标志，导致胶原过度沉积和进行性瘢痕形成。肺成纤维细胞的胶原产生依赖于甘氨酸的从头合成，甘氨酸是胶原蛋白中含量最丰富的氨基酸。SHMT2通过将一碳（1C）单位从丝氨酸转移至四氢叶酸（THF）来产生甘氨酸，生成5,10-亚甲基-THF（meTHF）。meTHF随后在线粒体1C途径中转化回THF。目前尚不清楚1C代谢如何促进胶原蛋白产生和纤维化。在此，我们证明TGF-β诱导人肺成纤维细胞中线粒体1C途径酶（包括MTHFD2）的表达。MTHFD2是TGF-β诱导的细胞甘氨酸积累和肺成纤维细胞胶原蛋白产生所必需的。MTHFD2的药理抑制可改善体内气管内博来霉素滴注后的纤维化反应。我们的发现提示线粒体1C代谢是IPF和其他纤维化疾病的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TGF-β信号如何通过一碳代谢调控肺成纤维细胞甘氨酸合成和胶原蛋白产生，以及靶向该通路能否改善肺纤维化。
- 核心机制
- TGF-β通过mTORC1和ATF4诱导线粒体一碳代谢酶MTHFD2、ALDH1L2和MTHFD1L表达；MTHFD2通过维持线粒体THF再生支持SHMT2介导的甘氨酸合成，进而促进胶原蛋白产生。
- 主要证据
- 在人肺成纤维细胞中，MTHFD2敲低或药理学抑制（DS18561882）减少TGF-β诱导的甘氨酸积累和胶原蛋白产生；在小鼠博来霉素模型中，DS18561882改善纤维化反应；患者scRNAseq和免疫组化显示MTHFD2在纤维化成纤维细胞中高表达。
- 研究意义
- 提示线粒体一碳代谢是IPF和其他纤维化疾病的治疗靶点，MTHFD2抑制剂可能对纤维化疾病有效。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MTHFD2对甘氨酸合成和胶原蛋白产生的功能验证
验证MTHFD2在TGF-β诱导的甘氨酸积累和胶原蛋白产生中的作用。
在HLFs中敲低MTHFD2，用TGF-β处理，检测胶原蛋白和α-SMA蛋白表达、甘氨酸水平（GC-MS）以及胶原蛋白分泌。
ALDH1L2和MTHFD1L的冗余性验证
确定ALDH1L2和MTHFD1L在支持甘氨酸合成和胶原蛋白产生中的相对贡献。
分别或联合敲低ALDH1L2和MTHFD1L，检测甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸水平及胶原蛋白表达。
MTHFD2药理学抑制的体外验证
验证MTHFD2抑制剂DS18561882对甘氨酸和胶原蛋白产生的影响。
用DS18561882处理HLFs，检测胶原蛋白表达、甘氨酸水平及代谢示踪。
MTHFD2在体内纤维化模型中的表达验证
分析MTHFD2在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型及IPF患者肺组织中的表达。
利用已发表的scRNAseq数据分析Mthfd2等基因表达；免疫组化检测小鼠和IPF患者肺组织MTHFD2蛋白。
MTHFD2抑制剂对体内纤维化反应的疗效验证
测试DS18561882对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的治疗作用。
小鼠气管内滴注博来霉素后，从第8天开始腹腔注射DS18561882或对照，通过microCT、组织学和羟脯氨酸含量评估纤维化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 成纤维细胞生长培养基2 | PromoCell | C023020 |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | 11054020 | |
| 最低必需培养基 | Gibco | 11095080 | |
| MEM维生素溶液 | Gibco | 1120052 | |
| TGF-β处理 | 转化生长因子-β | Peprotech | 100-21C |
| 药物处理 | DS18561882 | MedChemExpress | HY-130251 |
| TORIN1 | MedChemExpress | HY-13003 | |
| Rapalink-1 | MedChemExpress | HY-111373 | |
| 代谢标记 | 13C2-甘氨酸 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1017 |
| 2,3,3-D3-L-丝氨酸 | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-582 | |
| 13C3-L-丝氨酸 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1574 | |
| Western blot | 胶原蛋白1抗体 | Abcam | ab138492 |
| 胶原蛋白3抗体 | Proteintech | 22734-1-AP | |
| α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Sigma | A2547 | |
| MTHFD2抗体 | Proteintech | 12270-1-AP | |
| ALDH1L2抗体 | Proteintech | 21391-1-AP | |
| MTHFD1L抗体 | Proteintech | 18112-1-AP | |
| MTHFD1抗体 | Proteintech | 10794-1-AP | |
| ATF4抗体 | Proteintech | 10835-1-AP | |
| 磷酸化GCN2抗体 | Cell Signaling | 94668 | |
| GCN2抗体 | Cell Signaling | 3302 | |
| 磷酸化P70S6K抗体 | Cell Signaling | 9234 | |
| P70S6K抗体 | Cell Signaling | 9202 | |
| 嘌呤霉素抗体 | Millipore | MABE343 | |
| 纤连蛋白抗体 | Proteintech | 66042-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling | 2118 | |
| Vinculin抗体 | Cell Signaling | 13901 | |
| HRP标记抗兔抗体 | Cell Signaling | 7074 | |
| HRP标记抗小鼠抗体 | Cell Signaling | 7076 | |
| qPCR | GenElute哺乳动物总RNA小量制备试剂盒 | Sigma | RTN350 |
| iScript逆转录预混液 | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq通用SYBR Green预混液 | Bio-Rad | 172-5124 | |
| GC-MS | 甲氧胺试剂 | Thermo | TS-45950 |
| 细胞收缩实验 | 牛1型胶原凝胶 | Cell Biolabs | CBA201 |
| 甲酸检测 | 甲酸检测试剂盒 | Abcam | ab111748 |
| 羟脯氨酸检测 | 羟脯氨酸检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK357 |
| 免疫组化 | MTHFD2抗体 | Proteintech | 12270-1-AP |
| 生物素化抗兔IgG | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Elite试剂盒 | Vector Laboratories | PK-6100 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人肺成纤维细胞培养与TGF-β处理 | 细胞来源（Lonza正常CC-2512和IPF CC-7231）、接种密度1×10^5/12孔、血清饥饿24小时、TGF-β浓度1 ng/mL、处理时间24或48小时 阅读提示：Methods中Fibroblast culture小节 |
| siRNA敲低 | siRNA浓度250 pmol、转染程序A-024、细胞数1×10^6、Dharmacon产品编号 阅读提示：Methods中siRNA knockdowns小节 |
| 代谢示踪（GC-MS/LC-MS） | 示踪剂浓度400 μM（13C2-甘氨酸、2,3,3-D3-L-丝氨酸、13C3-L-丝氨酸）、标记时间48小时、培养基类型（MEM或DMEM） 阅读提示：Methods中Fibroblast culture及Gas chromatography-mass spectrometry小节 |
| MTHFD2抑制剂体外处理 | DS18561882浓度5 μM、与TGF-β同时加入、处理时间 阅读提示：Methods中Fibroblast culture小节及Fig. 6图注 |
| 博来霉素诱导小鼠肺纤维化模型 | 小鼠品系C57Bl/6J（8–12周龄，雄性）、博来霉素剂量（单次0.7 U/kg，多次0.5 U/kg）、给药途径气管内滴注、多次模型间隔14天（第0、14、28天） 阅读提示：Methods中Bleomycin-induced pulmonary fibrosis小节 |
| DS18561882体内给药 | 剂量100 mg/kg、给药途径腹腔注射、溶剂组成（10% DMSO, 40% PEG300, 5% Tween-80, 45% saline）、起始时间（末次博来霉素后第8天） 阅读提示：Methods中Bleomycin-induced pulmonary fibrosis小节 |