鉴定NF-κB调控的lncRNA PLUM
确定PLUM是否受NF-κB/p52调控并在高危MM中过表达
对NF-κB/p52敲低的MM细胞进行RNA-seq，整合MMRF CoMMpass患者转录组数据，鉴定LINC02362（PLUM）；用CRISPR敲低NF-κB/p52验证PLUM表达下调；比较NF-κB突变型与非突变型MM细胞系中PLUM表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
多发性骨髓瘤相关长非编码RNA PLUM通过增强PRC2介导的UPR通路激活赋予化疗耐药性
Multiple myeloma associated long non-coding RNA PLUM confers chemoresistance by enhancing PRC2 mediated UPR pathway activation.
实验完整度
高包含体外细胞系、患者数据队列、小鼠异种移植模型及组学分析，并有功能验证和机制验证
主要模型
NF-κB突变型多发性骨髓瘤细胞系KMS11和LP1 NF-κB突变型多发性骨髓瘤细胞系MM.1.S NF-κB非突变型多发性骨髓瘤细胞系XG7和H929 PLUM过表达KMS11皮下异种移植小鼠模型
重点核对
细胞系身份及NF-κB突变状态：KMS11、LP1、MM.1.S为NF-κB突变型，XG7、H929为NF-κB非突变型 PLUM敲低或过表达效率：shRNA或过表达 construct 的验证 药物处理浓度与时间：BTZ处理24小时，Len处理4天，用于IC50测定 体内实验分组与给药：BTZ 1 mg/kg腹腔注射，s-ASO-g12 15 µg瘤内注射，每组5或6只小鼠 RNA免疫沉淀（RIP）qPCR中EZH2抗体与IgG对照的比例及 enrichment 计算
摘要
多发性骨髓瘤（MM）是第二常见的血液系统恶性肿瘤，表现出遗传异质性导致治疗耐药。导致非经典NF-κB通路过度激活的复发性突变在复发难治性MM患者中高度流行，但驱动化疗耐药的确切机制尚不清楚。在此，我们鉴定了一个长非编码RNA，称为PLUM，其在NF-κB突变高危MM亚型和对VRd治疗方案难治的患者中过表达。机制上，PLUM与Polycomb抑制复合物2（PRC2）相互作用，调节其稳定性和组蛋白甲基转移酶活性，调节肿瘤抑制基因FOXO3和ZFP36的表达，从而激活未折叠蛋白反应（UPR）。重要的是，使用空间位阻反义寡核苷酸破坏PLUM-EZH2相互作用可在体内使骨髓瘤细胞对药物治疗重新敏感，这与PRC2稳定性和H3K27三甲基化活性的丧失相关。这些发现表明PLUM促进PRC2复合物的形成并增强EZH2活性，调节骨髓瘤表观基因组以介导化疗耐药。因此，靶向PLUM-EZH2相互作用可能是治疗复发难治性MM的临床有效策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 非经典NF-κB通路调控的长非编码RNA是否驱动多发性骨髓瘤的化疗耐药，及其分子机制是什么？
- 核心机制
- PLUM通过与EZH2相互作用，促进PRC2复合物形成并增强其H3K27三甲基化活性，抑制肿瘤抑制基因FOXO3和ZFP36的表达，进而激活未折叠蛋白反应（UPR）通路，介导多发性骨髓瘤化疗耐药。
- 主要证据
- 体外细胞系实验显示PLUM过表达增强增殖和BTZ/Len耐药，敲低诱导凋亡；RNA pull-down和RIP-qPCR证实PLUM与EZH2结合；ChIP-seq和ChIP-qPCR显示PLUM调控FOXO3/ZFP36的H3K27me3；体内异种移植模型证实PLUM过表达促进肿瘤生长和BTZ耐药，s-ASO-g12联合BTZ增强疗效。
- 研究意义
- 靶向PLUM-EZH2相互作用可能成为治疗复发难治性多发性骨髓瘤的临床有效策略，PLUM可能作为高危MM患者的生物标志物或治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
表征PLUM的分子特征和亚细胞定位
明确PLUM的转录本异构体、编码能力和细胞内定位
用5′RACE和3′RACE鉴定PLUM异构体；用HA标签构建体验证PLUM不编码蛋白；用RNA-FISH和亚细胞分离确定PLUM主要定位于细胞核。
验证PLUM对MM细胞增殖和药物敏感性的功能影响
确定PLUM是否促进MM细胞增殖并赋予化疗耐药
在NF-κB突变型和非突变型MM细胞系中过表达或敲低PLUM，检测增殖和凋亡；用BTZ和Len处理测定IC50；在PLUM过表达KMS11异种移植小鼠中评估肿瘤生长和BTZ反应。
鉴定PLUM的相互作用蛋白及结合区域
确定PLUM与PRC2复合物的直接相互作用及其关键结构域
用RNA pull-down结合质谱鉴定PLUM结合蛋白；用RIP-qPCR和RNA FISH-IF验证PLUM与EZH2的相互作用；用截短突变体确定exon7为EZH2结合关键区域；用co-IP验证PLUM对PRC2复合物形成的影响。
设计并验证靶向PLUM-EZH2相互作用的空间位阻ASO
评估靶向PLUM-EZH2相互作用的ASO是否能破坏PRC2复合物并逆转耐药
基于PLUM-EZH2对接模型设计10条2′MOE-LNA修饰的空间位阻ASO；用RIP-qPCR筛选有效ASO；检测s-ASO对PRC2复合物形成、H3K27me3水平、增殖、凋亡及BTZ/Len敏感性的影响；在体内评估s-ASO-g12单独及联合BTZ的抗肿瘤效果。
解析PLUM通过PRC2调控UPR通路的分子机制
确定PLUM调控的下游靶基因及UPR通路激活的机制
对PLUM敲低的KMS11细胞进行RNA-seq和H3K27me3 ChIP-seq；整合分析鉴定FOXO3和ZFP36为PLUM/EZH2调控靶点；用ChIP-qPCR验证H3K27me3富集变化；用敲低实验验证FOXO3/ZFP36对UPR通路和化疗敏感性的影响；用IRE1α敲低验证UPR通路在PLUM介导耐药中的作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Hyclone | SH30027.01 |
| 胎牛血清 | Sigma | F7524 | |
| L-谷氨酰胺 | Hyclone | SH30027.01 | |
| 白细胞介素-6 | PeproTech | 200-06-20UG | |
| β-巯基乙醇 | Sigma | 444203 | |
| 杜尔贝科改良 Eagle 培养基 | Hyclone | SH30243.01 | |
| 胰蛋白酶/EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 支原体PCR检测试剂盒 | Abm | G238 | |
| 药物处理 | 细胞培养用硼替佐米 | Merck Sigma | 5.04314.0001CN |
| 动物实验 | 体内用硼替佐米 | MedChem Express | HY-10227 |
| 药物处理 | 来那度胺 | MedChem Express | HY-A0003 |
| Ro-3306 CDK1/2抑制剂 | MedChem Express | HY-12529 | |
| MG132 | Abcam | ab141003 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Merck | 5056489001 | |
| Clarity Western ECL底物 | BioRad | 1705062 | |
| Chemidoc XRS成像系统 | BioRad | -- | |
| RNA提取与qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| TOYOBO ReverTra Ace qPCR RT master mix试剂盒 | TOYOBO | FSQ-301 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725272 | |
| RNA pull-down | MyOne C1磁珠 | Invitrogen | 65001 |
| RNase抑制剂 | Life technologies | AM2696 | |
| 酵母tRNA | Life technologies | M0491L | |
| Q5聚合酶 | NEB | M0491L | |
| T7 RNA聚合酶 | Life technologies | EP0113 | |
| NTP混合物 | Life technologies | R0481 | |
| 质谱 | NuPAGE Bis-Tris预制胶 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胶体蓝染色试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| EASY-nLC 1200系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Q Exactive HF质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RIP | 蛋白A/G磁珠 | -- | -- |
| Co-IP | Protein-G Dynabeads | Life Technologies | 10004D |
| 流式细胞术 | Annexin V-Alexa Fluor 350 | Invitrogen | A23202 |
| 碘化丙啶 | Merck | P4864 | |
| BD LSRFortessa X-20流式细胞仪 | BD | -- | |
| RNA-EMSA | LightShift化学发光RNA EMSA试剂盒 | Thermo Scientific | 20158 |
| RNA-seq | Qubit RNA BR检测 | Thermo Scientific | Q10210 |
| RNA 6000 Nano试剂盒 | Agilent | -- | |
| Turbo DNase I | Thermo Scientific | AM2238 | |
| NEBNext Poly(A) mRNA磁力分离模块 | NEB | E7490S | |
| NEBNext Ultra II定向RNA文库构建试剂盒 | NEB | E7760S | |
| ChIP | 蛋白G琼脂糖珠 | -- | -- |
| QIAquick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- | |
| ChIP-seq | Qubit 1× dsDNA高灵敏度和宽范围检测试剂盒 | Life Technologies | Q33231 |
| NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒（Illumina） | NEB | E7645S; E7103S | |
| DNA高灵敏度分析试剂盒 | Agilent | 5067-4626 | |
| ASO转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | 13778075 |
| 动物实验 | 基质胶 | BD | -- |
| Western blot | 抗兔IgG-HRP偶联二抗 | santacruz | sc-2357 |
| 抗小鼠IgG-HRP偶联二抗 | santacruz | sc-516102 | |
| NFKB2抗体 | CST | 3017 | |
| 磷酸化EZH2抗体 | Thermo | PA5114574 | |
| EZH2抗体 | Thermo | 491043 | |
| EED抗体 | Thermo | PA534430 | |
| SUZ12抗体 | CST | 3737S | |
| 磷酸化IRE1α抗体 | Abcam | ab243665 | |
| IRE1α抗体 | Santacruz | sc-390960 | |
| sXBP1抗体 | santacruz | sc-133132 | |
| 磷酸化eIF2α抗体 | CST | 9721 | |
| eIF2α抗体 | santacruz | sc-133132 | |
| ATF6α抗体 | santacruz | sc-166659 | |
| GAPDH抗体 | santacruz | sc-32233 | |
| HA抗体 | Santacruz | sc-7392 | |
| 磷酸化CDK1/2抗体 | CST | 4539S | |
| CDK1/2抗体 | santacruz | sc-53219 | |
| H3K27me3抗体 | CST | 9733S | |
| H3抗体 | santacruz | sc-517576 | |
| FOXO3抗体 | santacruz | sc-48348 | |
| ZFP36抗体 | santacruz | sc-374305 | |
| ChIP | H3K27me3抗体 | CST | 9733S |
| EZH2抗体 | Life technologies | 491043 | |
| HA抗体 | Genomax | 901503 | |
| 抗兔IgG | CST | 7074S |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系培养与身份验证 | 细胞系来源（KMS11、LP1、MM.1.S、XG7、H929等）、NF-κB突变状态、STR鉴定、支原体检测 阅读提示：Methods中Cell culture小节 |
| PLUM过表达或敲低 | 构建体（FL-PLUM isoform 201）、shRNA序列、转染/ transduction 效率、筛选药物浓度及时间 阅读提示：Methods中Lentiviral production and transduction及Short hairpin RNA-expressing plasmid construction小节，Supplementary Table 1和2 |
| 药物敏感性IC50测定 | BTZ处理24小时，Len处理4天，药物浓度梯度，细胞接种数（5×10^4/孔），MTT检测时间 阅读提示：Methods中MTT assay for IC50 survival curve小节及Figure legends 2c–f, 5j–k, 6f–g |
| RNA pull-down与质谱 | 生物素化RNA模板（FL、ΔExon1、ΔExon7）、核提取物用量（500 µg）、磁珠（MyOne C1）、孵育条件、质谱数据过滤标准 阅读提示：Methods中Probe preparation and RNA-protein pull down assay及Mass spectrometry小节 |
| RIP-qPCR | 交联条件（1%甲醛15分钟）、核分离、超声条件、抗体用量（10 µg/1 mg上清）、qPCR引物 阅读提示：Methods中RNA immunoprecipitation (RIP)—qPCR小节及Supplementary Table 2 |
| ChIP-seq和ChIP-qPCR | 交联条件（1%甲醛12分钟）、超声片段大小（200–500 bp）、抗体用量（H3K27me3 4 µg/8×10^6细胞；EZH2 8 µg/8×10^6细胞）、测序深度（110G/lane） 阅读提示：Methods中Chromatin immunoprecipitation-Quantitative PCR (ChIP-qPCR) and ChIP-seq library preparation小节 |
| 体内异种移植实验 | 小鼠品系（Balb/c RAG−/− IL2Rγ−/−，6–10周龄）、细胞接种量（5×10^6）、基质胶浓度（50%）、分组随机化、BTZ剂量（1 mg/kg）和给药途径（腹腔注射）、s-ASO-g12剂量（15 µg）和给药途径（瘤内注射）、给药频率（每3–4天，每周两次，最多5次）、肿瘤体积测量和终点（2000 mm3） 阅读提示：Methods中Mouse xenograft experiment和ASO and BTZ combination drug response studies小节 |