现场分离株中HAT表达与RS的相关性分析
评估各HAT基因表达与环状体存活表型的关联
对30株培养适应现场分离株和43株亚克隆现场分离株进行RT-qPCR检测10个推定HAT基因转录水平，并进行RSA0-3h测定存活率，进行相关性分析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
表观遗传赋予的恶性疟原虫环状体对青蒿素治疗的存活
Epigenetically conferred ring-stage survival in Plasmodium falciparum against artemisinin treatment.
实验完整度
高包含现场分离株、CRISPR敲低/敲除、scRNA-seq、ChIP-seq、代谢组学及体外功能验证等多层级证据。
主要模型
恶性疟原虫3D7-G7株 恶性疟原虫现场分离株A8（PfK13 C580Y）和A5（PfK13 G538V）及其回复突变株 30株培养适应现场分离株及43株亚克隆现场分离株 Pfmyst-ty1-glmS敲低株（PfM-KD）
重点核对
RSA0-3h使用700 nM、200 nM或50 nM DHA处理6小时，72小时后计数存活率 GlcN处理6小时诱导Pfmyst敲低，并通过Western blot和RT-qPCR验证 PfK13突变株A8（C580Y）和A5（G538V）及其CRISPR/Cas9回复突变株作为对照 NU9056（PfMYST抑制剂）及curcumin、anacardic acid（PfGCN5抑制剂）预处理12小时后进行RSA0-3h 单细胞RNA测序在0、6、9 hpi收集，200 nM DHA处理
摘要
青蒿素及其半合成衍生物（ART）是全球青蒿素联合疗法中的关键药物。尽管ART有效，但少部分年轻的胞内环状体寄生虫可在药物短半衰期内存活，若未被配伍药物清除，休眠体可导致再燃。恶性疟原虫蛋白（PfK13）Kelch螺旋桨区域的某些突变与较高的环状体存活（RS）相关，RS高于1%可视为“青蒿素部分耐药”的特征。新出现的证据表明表观遗传调节因子可能参与RS。在此，我们报告了对30株培养适应现场分离株和43株亚克隆现场分离株中所有推定恶性疟原虫组蛋白乙酰转移酶（HAT）的系统评估。只有PfMYST与RS表型调节完全相关。敲低实验证实Pfmyst表达与这些调节的关联，并有证据表明代谢过程改变。通过单细胞RNA测序、ChIP-seq分析和CRISPR/cas9遗传操作，鉴定并功能验证了PfMYST靶向的RS相关基因。多组学分析表明PfMYST和PfK13机制在RS中存在显著相互作用。PfMYST表观遗传调节扩展至其他抗疟药，包括阿莫地喹、乙胺嘧啶、氯喹和咯萘啶。总之，我们的发现为ART和其他抗疟药脉冲后恶性疟原虫RS的表观遗传调控机制提供了重要信息。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 恶性疟原虫环状体在青蒿素脉冲后存活的表观遗传调控机制是什么？
- 核心机制
- PfMYST通过组蛋白H4K5ac和H4K8ac乙酰化调控下游基因表达，影响代谢重编程和细胞周期，从而介导环状体存活；PfMYST与PfK13机制在RS中存在相互作用。
- 主要证据
- 现场分离株和亚克隆中Pfmyst转录与RS负相关；Pfmyst敲低增加RS并延迟环状体发育；scRNA-seq鉴定PfMYST靶基因；ChIP-seq显示H4K5ac/H4K8ac减少；代谢组学显示能量代谢改变。
- 研究意义
- 揭示了恶性疟原虫RS的表观遗传调控机制，为理解青蒿素部分耐药和开发潜在治疗策略提供信息。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PfMYST敲低株的构建与验证
验证Pfmyst表达降低对RS表型的影响
通过CRISPR/Cas9将glmS核酶和Ty1标签融合至Pfmyst 3'端，构建PfM-KD株；GlcN处理诱导敲低，Western blot和RT-qPCR验证；RSA0-3h检测存活率。
PfMYST化学抑制对RS的影响
通过抑制剂验证PfMYST活性对RS的贡献
用PfMYST特异性抑制剂NU9056和PfGCN5抑制剂curcumin、anacardic acid预处理寄生虫，然后进行RSA0-3h。
环状体发育延迟和阶段特异性存活分析
检测PfMYST敲低是否导致环状体发育延迟及阶段特异性药物敏感性
对高度同步的PfM-KD寄生虫进行GlcN处理，50 nM DHA脉冲后每6小时涂片观察发育阶段；并进行RSA0-3h、RSA9-12h、TSA18-21h。
体外再燃实验
评估PfMYST敲低对DHA处理后寄生虫再燃时间的影响
对PfM-KD、3D7、PfK13突变株及回复株进行三次700 nM DHA脉冲（每次6小时，间隔24小时），监测再燃曲线。
靶向代谢组学分析
比较PfMYST敲低和PfK13突变株在DHA暴露后的代谢谱变化
对高度同步环状体（0–3 hpi）进行GlcN预处理24小时，50 nM DHA处理3或6小时，提取代谢物，用UPLC-MS/MS检测19种中心碳代谢化合物。
单细胞RNA测序分析
鉴定PfMYST调控的靶基因及其与PfK13机制的交互
对WT、PfM-KD、PfK13突变株等在0、6、9 hpi进行scRNA-seq，分析细胞聚类、差异表达基因和通路。
ChIP-seq分析组蛋白乙酰化修饰
检测PfMYST敲低后H4K5ac和H4K8ac在基因组上的分布变化
构建PfMYST-HA-GFP转基因株，进行ChIP-seq，检测H4K5ac、H4K8ac等修饰。
候选靶基因的功能验证
验证scRNA-seq鉴定的PfMYST靶基因对RS的影响
通过CRISPR/Cas9对10个候选基因进行过表达、敲除或敲低，进行RSA0-3h和再燃实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| Albumax I | -- | -- | |
| 庆大霉素 | -- | -- | |
| 转染 | pL6cs-sgRNA质粒 | -- | -- |
| pUF1-Cas9质粒 | -- | -- | |
| 药物选择 | 杀稻瘟菌素S | Gibco | R21001 |
| WR99210 | Sigma | SML2976 | |
| DSM1 | Millipore | 5.33304 | |
| DNA提取 | TIANamp基因组DNA提取试剂盒 | Tiangen | DP304 |
| PCR产物纯化 | TIANgel Midi纯化试剂盒 | Tiangen | DP209 |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | -- | -- |
| 总RNA纯化试剂盒 | Vazyme Biotech Co., Ltd | -- | |
| HiScript Q逆转录预混液 | Vazyme Biotech Co., Ltd | -- | |
| SYBR Green I试剂盒 | Vazyme Biotech Co., Ltd | -- | |
| ChIP-seq | 甲醛 | Sigma | F8775 |
| 兔抗GFP抗体 | Abcam | ab290 | |
| 兔IgG | Abcam | ab171870 | |
| 抗H3K9ac抗体 | Millipore | 07-352 | |
| 抗H3K9me3抗体 | Abcam | ab8898 | |
| 抗H4K8ac抗体 | Millipore | 07-328 | |
| Protein A/G磁珠 | Pierce | -- | |
| MinElute PCR纯化试剂盒 | Qiagen | 28006 | |
| End-it DNA末端修复试剂盒 | Epicenter | ER81050 | |
| Klenow片段（3´→5´ exo-）试剂盒 | NEB | M0212L | |
| 快速连接试剂盒 | NEB | M2200L | |
| KAPA Biosystems KB2500 | KAPA Biosystems | KB2500 | |
| 单细胞RNA测序 | Hoechst 33342 | -- | -- |
| Chromium单细胞3'试剂盒v3 | 10x Genomics | -- | |
| 免疫荧光 | 鼠抗Ty1抗体 | Sigma | SAB4800032 |
| 兔抗HA抗体 | Abcam | ab9110 | |
| Alexa 488山羊抗鼠抗体 | Thermo | A11029 | |
| Alexa 568山羊抗兔抗体 | Thermo | A11036 | |
| 代谢组学 | QTRAP® 6500+质谱仪 | SCIEX | -- |
| BEH C18色谱柱 | -- | -- | |
| HAT抑制试验 | NU9056 | -- | -- |
| 姜黄素 | -- | -- | |
| 漆树酸 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| RSA0-3h | DHA浓度（50、200、700 nM）、处理时间6小时、GlcN预处理6小时、寄生虫同步化方法、存活率计算时间点72小时 阅读提示：Methods '0–3 h Ring stage survival assay (RSA0-3h)'及Figure 1、2、3图注 |
| Pfmyst敲低 | GlcN浓度5 mM、处理时间6小时、敲低验证方法（Western blot、RT-qPCR）、对照株（3D7、Pfrrp6-Ty1-glmS） 阅读提示：Methods 'Parasite culture, plasmid construction and transfection'及Figure 2图注 |
| HAT抑制试验 | 抑制剂浓度（10×IC50）、预处理时间12小时、抑制剂种类（NU9056、curcumin、anacardic acid） 阅读提示：Methods 'Histone acetyltransferases (HATs) inhibition assay'及Figure 2f图注 |
| 单细胞RNA测序 | DHA浓度200 nM、收集时间点（0、6、9 hpi）、GlcN预处理24小时、细胞分选方法 阅读提示：Methods 'Single-cell RNA sequencing and data analysis'及Figure 5a图注 |
| ChIP-seq | 抗体种类和用量、交联条件、超声破碎条件、生物学重复数 阅读提示：Methods 'ChIP-seq and data analysis' |
| 靶向代谢组学 | DHA浓度50 nM、处理时间3或6小时、GlcN预处理24小时、检测的19种代谢物、生物学重复数 阅读提示：Methods 'Targeted metabolomics analysis and data processing'及Figure 4b图注 |
| 再燃实验 | DHA浓度700 nM、三次6小时脉冲、再燃监测时间点 阅读提示：Methods 'Recrudescence assay'及Figure 4a图注 |