PRT1ZZ与N-degron肽结合亲和力测定
定量验证PRT1ZZ对2型N-degron的识别能力及结合强度。
用ITC测定PRT1ZZ与Tyr-Lys-Phe肽的解离常数，并检测缺失ZZ结构域的RING1+RING2与同一肽段的结合。
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PRT1植物N-recognin识别并泛素化2型N-degron底物的结构基础
Structural basis for the recognition and ubiquitylation of type-2 N-degron substrate by PRT1 plant N-recognin.
实验完整度
高包含晶体结构解析、ITC结合测定、定点突变、体外泛素化、SEC-SAXS/MALS及FRET释放实验，多层级验证识别与催化机制
主要模型
拟南芥PRT1蛋白及其ZZ结构域 Tyr61-BB（BIG BROTHER）N-degron底物 Tyr61-BBV198E泛素化缺陷底物 YKF-CP8GFP模型底物
重点核对
PRT1ZZ与Tyr-Lys-Phe肽的ITC解离常数KD为10.1 μM PRT1ZZ与YKFG、FKFG、WAAG复合物晶体结构分辨率分别为1.7、2.1、2.8 Å PRT1突变体Y317A、I333A、F352A及Y317A/I333A的ITC结合亲和力与体外泛素化活性 PRT1 4L/S（L79S/L82S/L246S/L249S）突变破坏RING二聚体后泛素化活性丧失 FRET泛素释放实验中PRT14L/S突变体活性较WT降低10倍
摘要
PROTEOLYSIS1（PRT1）是拟南芥的一种N-recognin，可识别其底物N端芳香族疏水残基（Tyr/Phe/Trp），并对其进行泛素化以通过泛素-蛋白酶体系统降解。本文报道了PRT1的ZZ结构域（PRT1ZZ）与大体积疏水N-degron肽段复合物的结构。与其他ZZ结构域不同，PRT1ZZ具有一个含两个疏水区域的异常结合位点。N-degron的N端芳香族残基与柔性环中的Ile333和Phe352相互作用，这些环发生构象变化。值得注意的是，我们鉴定出底物N端起第三个残基参与与PRT1ZZ的疏水网络。此外，AlphaFold预测和生化实验表明，PRT1的串联RING1和RING2结构域发生分子内相互作用。单个蛋白中的二聚化RING结构域是RING型E3连接酶中的独特特征。使用N端酪氨酸暴露的底物BIG BROTHER进行的生化实验表明，分子内RING二聚体对PRT1的强活性至关重要。因此，本研究拓展了对N-degron通路结构类型的认识，并为含串联RING结构域E3连接酶的调控提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 植物N-recognin PRT1如何识别2型大体积疏水Arg/N-degron底物，以及其串联RING结构域如何调控E3泛素化活性。
- 核心机制
- PRT1ZZ通过柔性环L2和L3的构象变化形成含两个疏水区域的结合位点，Tyr317、Ile333和Phe352与N-degron第一位芳香族残基及第三位Phe形成疏水网络；RING1与RING2通过四个Leu残基形成分子内异源二聚体，维持E3连接酶活性。
- 主要证据
- PRT1ZZ与YKFG、FKFG、WAAG复合物晶体结构、ITC结合测定、PRT1关键残基突变体的体外泛素化实验，以及SEC-SAXS、SEC-MALS和FRET泛素释放实验。
- 研究意义
- 拓展了对N-degron通路结构类型的认识，特别是植物系统，并为含串联RING结构域E3泛素连接酶的调控机制提供了见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PRT1ZZ无配体及复合物晶体结构解析
确定PRT1ZZ识别2型N-degron的结构基础与构象变化。
用SAD法在Zn吸收边解析无配体PRT1ZZ结构，并将YKFG、FKFG、WAAG N-degron融合于ZZ结构域N端后解析复合物结构。
关键残基突变与N-degron序列对结合的影响
验证Tyr317、Ile333、Phe352及N-degron第三位残基在疏水网络中的作用。
用ITC测定FL PRT1WT及Y317A、I333A、Y317A/I333A、F352A突变体与YKF、YKA、YAA等肽段的结合亲和力。
体外泛素化活性验证
评估PRT1关键残基及RING二聚化对底物泛素化的影响。
以Tyr61-BBV198E、YAA-BBV198E和YKF-CP8GFP为底物，在E1、E2、Ub、ATP和MgCl2存在下进行体外泛素化反应，检测PRT1WT及突变体的多聚泛素化活性。
PRT1整体构象与RING二聚化表征
确定PRT1在溶液中的整体形状及RING1与RING2是否形成分子内二聚体。
用SEC-SAXS和SEC-MALS分析FL PRT1及RING结构域，并用AlphaFold预测RING1+RING2结构；构建2L/S和4L/S突变体破坏疏水界面。
FRET泛素释放动力学测定
定量比较PRT1WT与RING二聚化破坏突变体的E2~Ub释放活性。
用FITC标记AtUBC8和AlexaFluor 594标记Ub制备FRET E2~Ub偶联物，加入PRT1WT或4L/S突变体后监测FRET信号衰减。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证泛素化活性
验证溶液构象与寡聚状态
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白纯化 | HisTrap HP层析柱 | Cytiva | 17524802 |
| HiTrap Q HP层析柱 | Cytiva | 17115301 | |
| HiLoad Superdex 75 16/600 pg层析柱 | Cytiva | 28989333 | |
| HiTrap Blue HP层析柱 | Cytiva | 17041301 | |
| 结晶 | Crystal Screen筛选试剂盒 | Hampton Research | HR2-130 |
| Morpheus结晶试剂盒 | Molecular Dimensions | MD1-46 | |
| Wizard Classic 3结晶试剂盒 | Rigaku | 1009533 | |
| 等温滴定量热 | Microcal PEAQ-ITC微量等温滴定量热仪 | Malvern Panalytical | -- |
| 体外泛素化实验 | 抗FLAG标签抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166355 |
| 抗泛素抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8017 | |
| HRP标记抗His抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 | |
| ECL Prime蛋白质印迹检测试剂 | Cytiva | RPN2232 | |
| 抗GFP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体 | Invitrogen | 31430 | |
| SEC-SAXS | S200 increase 10/300 GL层析柱 | Cytiva | 28990944 |
| PILATUS3 2M X射线探测器 | DECTRIS | -- | |
| SEC-MALS | S75 Increase 10/300 GL层析柱 | Cytiva | 29148721 |
| miniDAWN光散射仪 | Wyatt Technology | -- | |
| FRET泛素释放实验 | AF594 C5马来酰亚胺 | Invitrogen | A10256 |
| 384孔黑色平底板 | Corning | 3621 | |
| SpectraMax iD5酶标仪 | Molecular Devices | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PRT1ZZ与N-degron肽结合亲和力测定 | PRT1ZZ与Tyr-Lys-Phe肽KD=10.1 μM；蛋白浓度45~55 μM、肽浓度约550 μM；25 °C；19次注射、每次2 μL 阅读提示：Results第1段与Methods中Isothermal titration calorimetry小节 |
| 复合物晶体结构解析 | N-degron序列YKFG/FKFG/WAAG融合于ZZ结构域N端；LC3B经ATG4B蛋白酶切除暴露N端；晶体分辨率1.7/2.1/2.8 Å 阅读提示：Results中ZZ domain structure in complex与Methods中Crystallization、Data collection小节及Supplementary Table 1 |
| 关键残基突变体结合与泛素化 | 突变位点Y317A、I333A、Y317A/I333A、F352A；底物Tyr61-BBV198E与YAA-BBV198E；PRT1浓度0.5 μM、反应3 h、30 °C 阅读提示：Results中Hydrophobic network与Ubiquitylation activity小节的图6及Methods中In vitro ubiquitylation assay |
| RING二聚化破坏突变 | RING1 L79S/L82S与RING2 L246S/L249S；2L/S与4L/S组合；SEC-MALS混合比例1:1、终浓度3 mg/mL 阅读提示：Results中Overall shape of PRT1与图7及Methods中SEC-MALS小节 |
| FRET泛素释放动力学 | 125 nM E2~Ub、1 μM PRT1变体、30 °C监测3 h；PRT14L/S活性降低10倍；三个独立重复 阅读提示：Results图7f与Methods中FRET-based ubiquitin discharge assay |