多组学队列样本采集与数据生成
获取WT和NAT样本的基因组、转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组数据，以全面描述分子特征。
收集96例WT患者的91例WT样本和74例NAT样本，进行WES、RNA-seq、定量蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析。
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肾母细胞瘤的综合蛋白质基因组学表征
Integrative proteogenomic characterization of Wilms tumor.
实验完整度
高多组学队列（WES、转录组、蛋白质组、磷酸化蛋白质组）结合细胞系功能与机制验证（EHMT2敲低、抑制剂处理、RNA-seq）
主要模型
肾母细胞瘤患者肿瘤组织及癌旁正常肾组织 SK-NEP-1细胞系 293T细胞系
重点核对
WT和NAT样本的蛋白质组学TMT标记定量：88例WT和71例NAT，每样本两个技术重复 磷酸化蛋白质组学：23对WT和NAT样本，每样本一个技术重复 RNA-seq：62例WT和37例NAT样本 WES：36例WT样本 EHMT2敲低功能实验：SK-NEP-1细胞，siRNA转染72小时，Western blot和qPCR验证，每组三个生物学重复
摘要
肾母细胞瘤（WT）是最常见的儿童肾脏恶性肿瘤，与成人癌症相比，其突变负荷相对较低，这阻碍了靶向治疗的发展。为了阐明WT的分子图谱，我们对WT及肿瘤邻近正常肾组织进行了整合的蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学、转录组学和外显子组测序分析。我们的多组学方法揭示了预后相关的遗传改变、不同的分子亚群、免疫微环境特征以及潜在的生物标志物和治疗靶点。基于蛋白质组和转录组的分层识别出三个具有独特特征的分子亚群，它们与不同的组织病理学亚型以及胚胎肾发育不同阶段的推测细胞起源相关。值得注意的是，我们发现EHMT2是一个有前景的预后生物标志物和治疗靶点，与表观遗传调控和Wnt/β-catenin通路相关。在这项工作中，我们提供了WT的综合分子表征，为其发病机制提供了有价值的见解，并为未来的治疗开发提供了基础资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肾母细胞瘤的分子图谱如何？能否通过多组学整合分析识别分子亚群、预后标志物和治疗靶点？
- 核心机制
- EHMT2通过调控H3K9二甲基化影响rRNA转录，并可能通过Wnt/β-catenin通路和细胞周期调控促进WT细胞增殖；Wnt/β-catenin通路突变与间质表型相关。
- 主要证据
- 对WT和NAT样本进行WES、RNA-seq、定量蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析，识别三个分子亚群；在SK-NEP-1细胞中敲低EHMT2导致H3K9二甲基化降低、G1期阻滞、增殖抑制、pre-rRNA水平下降，RNA-seq显示Wnt信号、细胞周期和肾发生相关基因下调；EHMT2抑制剂BIX-01294处理降低H3K9二甲基化。
- 研究意义
- 提供了WT的综合分子表征，为发病机制提供了见解，并为进一步治疗开发提供了基础资源；EHMT2被确定为有前景的预后生物标志物和治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
差异表达与通路富集分析
识别WT与NAT之间的差异表达基因/蛋白质/磷酸化蛋白质及其富集的通路。
在mRNA、蛋白质和磷酸化蛋白质水平进行差异表达分析，并进行功能富集分析和激酶活性推断。
基因组改变及其对表达的影响分析
分析体细胞突变和拷贝数改变及其与mRNA/蛋白质表达的相关性。
通过WES识别显著突变基因，通过GISTIC2分析拷贝数改变，并计算CNA与mRNA/蛋白质的Spearman相关性。
基于多组学的分子亚群识别
基于转录组和蛋白质组数据对WT进行分子分层。
使用CancerSubtypes包中的相似性网络融合（SNF）和谱聚类对59例同时具有转录组和蛋白质组数据的WT样本进行聚类。
分子亚群特征与临床关联验证
验证分子亚群与组织病理学、临床特征和预后的关联，并在公共队列中验证。
分析各亚群的病理组成、基质/免疫评分、通路特征和激酶活性；使用NTP算法在TARGET队列中预测亚群并分析生存。
免疫微环境分析
表征WT的免疫微环境并与成人肾癌比较。
使用CIBERSORTx估计免疫细胞丰度，使用ESTIMATE计算免疫和基质评分，比较WT与TCGA肾癌数据。
EHMT2功能与机制验证
验证EHMT2在WT中的表达、功能及其调控机制。
在SK-NEP-1细胞中敲低EHMT2，检测H3K9二甲基化、细胞周期、增殖、pre-rRNA水平，并进行RNA-seq；使用EHMT2抑制剂BIX-01294处理细胞检测H3K9二甲基化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | McCoy's 5A培养基 | Thermo Fisher Scientific | 16600082 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270106 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| DMEM培养基 | Corning | 10-013-CVR | |
| 蛋白质提取 | 蛋白酶抑制剂 | Roche | 05892970001 |
| 蛋白质组学TMT标记 | TMT 6重标记试剂 | Thermo Fisher Scientific | 90066 |
| Western blot | GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 |
| RB抗体 | Cell Signaling Technology | 9309 | |
| 磷酸化RB S780抗体 | Cell Signaling Technology | 8180 | |
| 磷酸化RB S795抗体 | Cell Signaling Technology | 9301 | |
| 磷酸化RB S807/811抗体 | Cell Signaling Technology | 8516 | |
| CDK2抗体 | Cell Signaling Technology | 2546 | |
| 组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 4499 | |
| 二甲基化组蛋白H3（Lys9）抗体 | Cell Signaling Technology | 4658 | |
| EHMT2抗体 | Cell Signaling Technology | 3306 | |
| siRNA转染 | RFectSP siRNA转染试剂 | Changzhou Bio-generating Biotechnologies Corp. | 11025 |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| RNA提取 | TRIzol | Takara | T9108 |
| 逆转录 | PrimeScript逆转录试剂盒 | Takara | RR037A |
| qPCR | SYBR Green预混液 | Yeasen | 11198ES03 |
| EdU掺入实验 | Cell-Light EdU Apollo488体外试剂盒 | RiboBio | C10310-3 |
| 细胞周期分析 | 细胞周期与凋亡分析试剂盒 | Yeasen | 40301ES50 |
| EHMT2抑制剂处理 | BIX-01294 | Selleck | S8006 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白质组学分析 | 样本数量（88例WT和71例NAT）、技术重复（每样本两个）、TMT标记（6-plex）、蛋白质起始量（150 μg）、酶解条件（胰蛋白酶37°C过夜）、质谱参数（Q Exactive Plus，分辨率70,000/17,500） 阅读提示：Methods 'Quantitative proteomics analysis'小节 |
| 磷酸化蛋白质组学分析 | 样本数量（23对WT和NAT）、富集方法（TiO2 beads，bead-to-protein ratio 12:1）、质谱参数（分辨率70,000/35,000） 阅读提示：Methods 'Phosphoproteomics analysis'小节 |
| 全外显子组测序 | 样本数量（36例WT）、DNA起始量（0.6 μg）、片段大小（180-280 bp）、测序平台（Illumina NovaSeq）、读长（150 bp paired-end） 阅读提示：Methods 'Whole exome sequencing'小节 |
| RNA-seq | 样本数量（62例WT和37例NAT）、RNA起始量（3 μg）、测序平台（HiSeq）、读长（文中未明确说明） 阅读提示：Methods 'RNA extraction, library construction, and sequencing'小节 |
| EHMT2敲低功能实验 | 细胞系（SK-NEP-1）、siRNA靶序列（siEHMT2-1: GAGTGATGATGTCCACTCA; siEHMT2-2: CTCCAGGAATTTAACAAGA）、转染试剂（RFectSP，Cat No. 11025）、检测时间点（转染后72小时）、生物学重复（每组三个） 阅读提示：Methods 'Functional experiments'小节及Figure 7 legend |
| EHMT2抑制剂处理 | 抑制剂（BIX-01294，Selleck，S8006）、处理时间（24小时）、浓度梯度（文中未明确具体浓度）、检测指标（H3K9二甲基化） 阅读提示：Methods 'Functional experiments'小节及Figure 7i legend |