舌肌细胞的原代培养与鉴定
建立无成纤维细胞污染的舌肌细胞模型，并验证其对TSCC细胞的抑制作用。
从转基因B6.129 (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)小鼠舌组织分离mTMCs，通过形态、免疫荧光（Desmin、α-SMA、Vimentin、Collagen IV）和流式细胞术（PDGFRβ阴性）鉴定；与CaL27细胞直接或非接触共培养，评估mTMCs对肿瘤细胞的抑制作用。
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舌鳞状细胞癌诱导舌肌细胞向癌相关成纤维细胞的转分化
Transdifferentiation of tongue muscle cells into cancer-associated fibroblasts in response to tongue squamous cell carcinoma.
实验完整度
高包含体外细胞模型、4-NQO小鼠模型、scRNA-seq、谱系追踪及多基因敲除类器官移植，并有功能与机制验证。
主要模型
小鼠舌肌原代细胞（mTMCs） 小鼠舌鳞癌细胞（mTSCC）及CaL27细胞系 4-NQO诱导的TSCC小鼠模型 多基因敲除舌类器官模型
重点核对
mTMCs与mTSCC非接触共培养2周后形态及CAF标志物（Collagen IV、FAP、Vimentin）上调，肌标志物（MyHC、Desmin）下调 4-NQO小鼠模型中随TSCC进展PDGFRβ+ CAFs增加而MyHC+舌肌细胞减少 谱系追踪移植实验显示mCherry+舌肌来源细胞共表达PDGFRβ IL-17a抑制剂Secukinumab在0.075 μg/mL浓度下抑制mTMCs向CAFs转分化 Secukinumab（10 mg/kg，每周一次，共5周）抑制小鼠舌原位TSCC肿瘤生长
摘要
舌鳞状细胞癌（TSCC）是恶性口腔癌的重要亚型，以异质性肿瘤微环境（TME）为特征。舌是复杂的肌肉器官，其天然初始微环境在很大程度上不利于TSCC的发生和进展。然而，晚期TSCC表现出癌相关成纤维细胞（CAFs）的显著积累，表明微环境发生了剧烈转变。在本研究中，通过结合细胞模型评估和4-NQO诱导的TSCC小鼠模型的单细胞RNA测序数据，以及移植中线追踪实验的综合分析，我们阐明并证实了舌肌细胞（TMCs）在TSCC背景下转化为CAFs的转分化过程。此外，我们证明用IL-17a抑制剂靶向TSCC是抑制TMCs重编程为CAFs的可行策略。此外，我们的研究还确定了参与TMCs向CAFs转分化的四个关键标记基因：Thbs1、Crabp1、Ifi205和Cxcl5。总之，这些发现阐明了TSCC细胞诱导TMCs转分化为CAFs的机制，从而将舌的抑癌微环境转变为有利于TSCC进展的微环境。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 舌鳞状细胞癌进展过程中，舌肌细胞是否以及如何转分化为癌相关成纤维细胞（CAFs）？
- 核心机制
- TSCC细胞通过IL-17a信号通路诱导舌肌细胞（TMCs）转分化为CAFs，该过程伴随Thbs1、Crabp1、Ifi205和Cxcl5等基因上调。
- 主要证据
- 体外共培养显示mTMCs获得CAF表型；4-NQO小鼠模型及scRNA-seq显示TMCs减少而CAFs增加；谱系追踪证实TMCs来源细胞表达PDGFRβ；IL-17a抑制剂Secukinumab可抑制转分化并减缓肿瘤生长。
- 研究意义
- 揭示了TSCC将舌抑癌微环境转变为促癌微环境的机制，靶向IL-17a抑制TMCs向CAFs转分化可能成为减缓TSCC进展的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TSCC细胞诱导mTMCs转分化为CAFs的体外验证
验证TSCC细胞是否能在体外诱导舌肌细胞获得CAF表型和功能。
将mTMCs与mTSCC细胞非接触共培养或使用mTSCC条件培养基处理，通过细胞骨架染色、Western blot、增殖曲线、明胶酶谱和侵袭实验检测mTMCs的表型与功能变化。
4-NQO诱导TSCC小鼠模型的建立与动态分析
在体内验证TSCC进展过程中CAFs增加和舌肌细胞减少，并分期。
C57BL/6小鼠饮用4-NQO水溶液38周，每两周取样，通过H&E和免疫组化（MyHC、PDGFRβ）分析舌组织病理变化及CAFs/TMCs动态。
单细胞RNA测序解析CAFs来源与异质性
在转录组水平揭示TMCs作为CAFs来源之一，并鉴定CAF亚群及关键基因。
对正常舌组织和不同阶段TSCC组织进行scRNA-seq，分析间充质细胞亚群动态和分化轨迹，鉴定CAF亚群及标记基因。
体内谱系追踪验证TMCs向CAFs转分化
在动物模型中直接验证舌肌细胞可转分化为CAFs。
将mTSCC细胞与mTMCs混合原位注射至小鼠舌部，或使用Myf5-Cre;R26R-tdTomato谱系追踪小鼠原位注射mTSCC，通过免疫荧光共染PDGFRβ和mCherry/tdTomato检测转分化。
关键基因过表达对mTMCs向CAFs转分化的影响
验证Thbs1、Crabp1、Ifi205、Cxcl5和Serpina3n在TMCs向CAFs转分化中的作用。
在mTMCs中过表达上述基因，通过qRT-PCR、Western blot、细胞骨架染色、增殖曲线、明胶酶谱和侵袭实验检测CAF样特征及对mTSCC细胞的影响。
多基因敲除类器官模型构建及功能验证
利用类器官模型模拟TSCC不同阶段，验证过表达关键基因的mTMCs对肿瘤细胞恶性表型的影响。
利用CRISPR/Cas9构建Tp53 KO、Tp53/Cdkn2a DKO、Tp53/Cdkn2a/Notch1 TKO和Tp53/Cdkn2a/Notch1/Fat1 QKO类器官，原位移植评估致瘤性；用条件培养基处理早期和晚期类器官，检测增殖和侵袭。
IL-17a抑制剂干预TMCs向CAFs转分化及TSCC进展
验证靶向IL-17a能否抑制TMCs向CAFs转分化并减缓TSCC进展。
体外使用Secukinumab处理共培养体系，检测mTMCs表型变化；体内原位注射mTSCC后腹腔注射Secukinumab，评估肿瘤大小及CAFs/TMCs分布。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 基质胶 | Corning | -- |
| I型胶原酶 | Invitrogen | -- | |
| 胰酶EDTA | Merck Millipore | -- | |
| 马血清 | Gibco Life Technologies | -- | |
| 鸡胚提取物 | MP Biochemicals | -- | |
| DMEM/F12培养基 | Merck Millipore | -- | |
| 胎牛血清 | Biological Industries | -- | |
| Transwell小室（0.4 μm孔径） | Merck Millipore | -- | |
| 侵袭实验 | 基质胶 | Corning | -- |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| 免疫组化 | HRP标记抗兔免疫组化试剂盒 | MXB Biotechnologies | -- |
| 免疫荧光 | DAPI | Thermo Fisher | #D1306 |
| Alexa Fluor 488标记二抗 | Invitrogen | A21206 | |
| 抗PDGFRβ抗体 | abcam | ab32570 | |
| Alexa Fluor 647抗细胞角蛋白14抗体 | Proteintech | CL647-10143 | |
| Alexa Fluor 488抗IL-17a抗体 | Proteintech | CL488-98005 | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| 增强化学发光底物 | Thermo Fisher | -- | |
| 明胶酶谱 | 明胶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 考马斯亮蓝 | -- | -- | |
| 单细胞RNA测序 | MACS组织保存液 | Miltenyi Biotec | -- |
| I、II、IV型胶原酶 | Worthington | -- | |
| DNase I | Worthington | -- | |
| 70 μm细胞筛网 | Biologix | -- | |
| 35 μm细胞筛网 | BD Falcon | -- | |
| 钙黄绿素AM | Thermo Fisher | -- | |
| Draq 7 | BD Bioscience | -- | |
| 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 高灵敏度DNA芯片 | Agilent | -- | |
| Qubit高灵敏度DNA检测 | Thermo Fisher | -- | |
| 载体与转染 | pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体 | Addgene | -- |
| pENTR-mCherry和pLX-302载体 | Addgene | -- | |
| pSPAX2和pMD2G辅助质粒 | Addgene | -- | |
| Zeocin | Gibco Life Technologies | -- | |
| 嘌呤霉素 | Gibco Life Technologies | -- | |
| 类器官培养 | IV型胶原酶 | Thermo Fisher | -- |
| TrypLE消化酶 | Thermo Fisher | -- | |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| B27添加剂 | Invitrogen | -- | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 表皮生长因子 | PeproTech | -- | |
| Noggin | PeproTech | -- | |
| R-Spondin | PeproTech | -- | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 二氢睾酮 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Y27632 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 分散酶 | Corning | -- | |
| Histogel | Thermo Fisher | -- | |
| qRT-PCR | EZ-press RNA纯化试剂盒 | EZBioscience | -- |
| First Strand cDNA合成试剂盒ReverTra Ace | Toyobo | -- | |
| LightCycler® 480 SYBR-Green I Master | Roche Diagnostics | -- | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Biosharp | BS350A |
| 动物实验 | 司库奇尤单抗 | MedChemExpress | HY-P9927 |
| OCT组织冷冻包埋剂 | SAKURA | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| mTMCs与mTSCC非接触共培养 | 共培养时间（2周、15天、30天）、mTMCs接种密度（2×10^4/24孔）、Transwell孔径（0.4 μm）、培养基（DMEM+2% FBS） 阅读提示：Methods 'Cell co-cultured assay'及Figure 2图注 |
| 4-NQO诱导TSCC小鼠模型 | 4-NQO浓度（200 mg/L）、给药时间（38周）、小鼠品系（C57BL/6，雌性，4-6周龄）、取样频率（每两周） 阅读提示：Methods 'Animal experiments'及Figure 3a图注 |
| 谱系追踪移植实验 | 小鼠品系（Myf5-Cre;R26R-tdTomato）、注射细胞量（mTSCC 5×10^5）、注射部位（舌前部中央肌肉）、取样时间（4周） 阅读提示：Methods 'The lineage tracing experiments'及Figure 4g图注 |
| IL-17a抑制剂体内实验 | Secukinumab剂量（10 mg/kg）、给药频率（每周一次）、给药方式（腹腔注射）、治疗时长（5周）、小鼠品系（Bal B/C nu/nu） 阅读提示：Methods 'Animal experiments'及Figure 7g-j图注 |
| 多基因敲除类器官原位移植 | 类器官原位注射细胞量：文中未明确说明；移植后分析时间（6周）、小鼠品系（Bal B/C nu/nu） 阅读提示：Methods 'Primary tongue organoid reconstitution assay and 3D culture'及Figure 6a图注 |