验证WDR45在应激条件下定位于SG并调控SG解聚
探究WDR45是否被招募至SG并影响SG动态
用SA、热休克或山梨醇处理U2OS、iPSC来源神经元和SH-SY5Y，免疫染色检测WDR45与G3BP1共定位；利用siRNA或CRISPR敲除WDR45，检测SA或热休克后SG形成和解聚动态。
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β-螺旋蛋白相关神经退行性疾病蛋白WDR45通过与Caprin-1相分离调控应激颗粒解聚
β-propeller protein-associated neurodegeneration protein WDR45 regulates stress granule disassembly via phase separation with Caprin-1.
实验完整度
高包含体外相分离、多种细胞系敲除/敲低、患者iPSC来源神经元及蛋白纯化等多种证据层级，并有功能回补验证
主要模型
U2OS细胞系 HeLa细胞系 Neuro-2a（N2a）细胞系 BPAN患者iPSC来源中脑神经元
重点核对
WDR45敲除或敲低后U2OS、N2a、HeLa细胞中SA或热休克诱导的SG解聚延迟 WDR45与Caprin-1的相互作用及WD5结构域介导的相分离 BPAN相关WDR45突变体（如N202K、G204D、A209D、S210P、S251del）丧失凝聚物形成和Caprin-1结合能力 患者iPSC来源中脑神经元经SA应激后SG恢复延迟 WDR45敲除细胞中FUS-R521C或GR50阳性病理性SG积累增加
摘要
β-螺旋蛋白相关神经退行性疾病（BPAN）是一种由WDR45基因突变引起的罕见X连锁神经退行性疾病，但其分子机制尚不清楚。在此，我们发现WDR45在应激颗粒（SG）解聚中发挥作用，这一作用通过其与Caprin-1的相分离介导。我们证明WDR45通过其WD5结构域形成凝胶状凝聚物，竞争性将G3BP1从Caprin-1上置换下来，从而促进SG解聚。BPAN相关的WDR45突变损害凝聚物形成和Caprin-1相互作用，导致SG解聚延迟，这与更早的疾病发病年龄相关。WDR45缺失还加剧了肌萎缩侧索硬化相关的病理性SG，突显了其与神经退行性疾病的更广泛相关性。利用来自BPAN患者的iPSC来源的中脑神经元，我们证明了SG恢复延迟，直接将WDR45功能障碍与神经退行性变联系起来。这些发现确立了WDR45作为SG动态的关键调控因子，揭示了BPAN发病机制的潜在分子基础，并确定了与SG失调相关的神经退行性疾病的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- WDR45是否以及如何调控应激颗粒动态，BPAN相关突变如何影响该功能？
- 核心机制
- WDR45通过WD5结构域形成凝胶状凝聚物并与Caprin-1相分离，竞争性置换G3BP1与Caprin-1的结合，削弱SG核心网络，促进SG解聚。
- 主要证据
- 体外纯化蛋白相分离实验、FRAP、Co-IP、SIM超分辨成像、多种细胞系敲除/敲低后的SG动态分析、BPAN患者iPSC来源中脑神经元模型及BPAN相关突变体功能回补实验。
- 研究意义
- 揭示WDR45作为SG动态关键调控因子的新功能，为BPAN发病机制提供分子基础，并提示靶向WDR45-Caprin-1相互作用或调控SG动态可能成为BPAN及相关神经退行性疾病的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定WDR45与Caprin-1的相互作用及相分离特性
确定WDR45进入SG的分子机制及其相分离行为
通过WDR45-GFP免疫沉淀结合LC-MS/MS鉴定互作蛋白；Co-IP和GST pull-down验证WDR45与Caprin-1结合；纯化重组蛋白进行体外相分离实验、FRAP和1,6-己二醇处理。
验证WDR45与G3BP1竞争结合Caprin-1以促进SG解聚
阐明WDR45调控SG解聚的竞争性机制
在应激和恢复阶段检测WDR45与Caprin-1结合变化；在WDR45 KO和G3BP1/2 dKO细胞中检测G3BP1与Caprin-1结合；体外相分离实验逐渐增加WDR45或G3BP1浓度观察竞争。
确定WDR45的WD5结构域介导相分离和SG解聚
定位WDR45中介导凝聚物形成和Caprin-1相互作用的关键结构域
构建WDR45 WD结构域截短体，纯化蛋白进行体外相分离，Co-IP检测与Caprin-1结合，在U2OS细胞中检测截短体定位和回补SG解聚缺陷的能力。
评估BPAN相关WDR45突变对相分离和SG解聚的影响
探究BPAN相关突变是否损害WDR45的相分离和SG解聚功能
构建并纯化8种BPAN相关WDR45突变体（R13P、N61K、L98P、N202K、G204D、A209D、S210P、S251del），检测凝聚物形成、Caprin-1结合、体外相分离及回补SG解聚缺陷的能力。
验证WDR45缺失对病理性SG积累的影响
探究WDR45在ALS相关病理性SG形成中的作用
在WT和WDR45 KO细胞中转染FUS WT、FUS-R521C或GR50，48 h后免疫染色检测SG阳性细胞比例和面积。
利用BPAN患者iPSC来源中脑神经元验证SG恢复缺陷
在患者来源神经元模型中验证WDR45突变导致SG解聚延迟
将携带WDR45 c.827+1G>A突变的BPAN患者iPSC分化为中脑神经元，SA应激后检测SG恢复；纯化截短突变蛋白检测相分离和Caprin-1结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖Dulbecco改良Eagle培养基 | HyClone | SH30022.01 |
| DME/F-12培养基 | HyClone | SH30022.01 | |
| 胎牛血清 | HUANKE | HK-CH500 | |
| 青霉素-链霉素 | Vivacell | C3420-0100 | |
| 应激处理 | 山梨醇 | Sigma-Aldrich | S1876 |
| Western blot | Caprin-1抗体 | Proteintech | 15112-1-AP |
| GFP抗体 | Santa Cruz | sc-9996 | |
| GST抗体 | Proteintech | 10000-0-AP | |
| 6*His抗体 | Proteintech | 66005-1-Ig | |
| G3BP1抗体 | Santa Cruz | sc-365338 | |
| WDR45抗体 | Proteintech | 19194-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 19194-1-AP | |
| SQSTM1抗体 | Proteintech | 18420-1-AP | |
| LC3抗体 | HUABIO | ET1701-65 | |
| NUP98抗体 | HUABIO | HA722523 | |
| 免疫染色 | HA抗体 | Invitrogen | 26183 |
| TIAR抗体 | CST | 8509S | |
| Caprin-1抗体 | Proteintech | 66352-1-Ig | |
| G3BP1抗体 | Proteintech | 13057-2-AP | |
| TUJ1抗体 | Proteintech | 66375-1-Ig | |
| 质粒转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 |
| 质粒构建 | 无缝克隆试剂盒 | LABLEAD | D0204P |
| CRISPR敲除 | PX459质粒 | -- | -- |
| BbsI-HF限制性内切酶 | NEB | R3539S | |
| T4连接 | LABLEAD | T5205 | |
| 嘌呤霉素 | LABLEAD | P067 | |
| 慢病毒包装 | psPAX2包装质粒 | Addgene | #12260 |
| pMD2.G包膜质粒 | Addgene | #12259 | |
| RNA提取和RT-qPCR | MagZol试剂 | Magen | R4801-01 |
| RT-qPCR | 逆转录试剂盒 | YESEN | 11141ES10 |
| SYBR qPCR预混液 | Magen | MD70101 | |
| 蛋白纯化 | 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | LABLEAD | 0487 |
| His标签磁珠 | GenScript | L00666-100 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | LABLEAD | R1090 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | LABLEAD | C0101 | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| HRP标记二抗 | Jackson Immuno | 111-035-003 | |
| 增强化学发光试剂 | LABLEAD | E1050 | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
| 牛血清白蛋白 | LABLEAD | 0332-1 | |
| 含DAPI的抗荧光淬灭封片剂 | Solarbio | S2110 | |
| 免疫共沉淀 | GFP磁珠 | LABLEAD | GNM-50-2000 |
| IgG | Applygen | C1754 | |
| Protein A/G琼脂糖珠 | Thermo Scientific | 88802 | |
| GST pull-down | 谷胱甘肽磁珠 | GenScript | L00206-50 |
| 体外相分离 | XFD488 NHS酯 | AAT Bioquest | 1812 |
| XFD647 NHS酯 | AAT Bioquest | 1833 | |
| 活细胞成像 | 共聚焦培养皿 | Cellvis | D35C4-20-1.5-N |
| iPSC培养 | 基质胶 | Corning | 355247 |
| mTeSr Plus培养基 | STEMCELL technology | 100-0276 | |
| 中脑神经元分化 | 神经元包被基质 | DAXIANG | NK100107 |
| 神经祖细胞诱导培养基 | DAXIANG | NK100101 | |
| NPC扩增培养基 | DAXIANG | ND100102 | |
| 中脑分化培养基 | DAXIANG | NK100103 | |
| 中脑成熟培养基 | DAXIANG | NK100107 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 应激处理与SG动态检测 | SA浓度500 μM、处理时间1 h（U2OS）或45 min（神经元）或30 min（患者神经元）；热休克44°C 2 h（U2OS）或1 h（神经元）；山梨醇400 mM 2 h；恢复时间1.5 h、2 h、120 min、150 min 阅读提示：Methods中Cell culture and treatment及Figure legends图1、图3、图5、图7 |
| WDR45敲除/敲低细胞模型 | gRNA序列（WDR45: 5’-TGACTCAACAGCCACTTCG-3’；CAPRIN1 gRNA1/2；WDR45B gRNA1/2）；siRNA序列；嘌呤霉素筛选浓度1 μg/ml 阅读提示：Methods中CRISPR–Cas9-mediated knockout cell lines及siRNA transfection and RT-qPCR |
| 体外相分离实验 | 蛋白浓度（WDR45细胞浓度34 nM）；NaCl浓度150 mM；蛋白摩尔比1:1；1,6-己二醇处理；荧光标记XFD488/XFD647 NHS Ester 阅读提示：Methods中In vitro phase separation assay及Figure legends图2、图3、图4、图5 |
| BPAN患者iPSC来源中脑神经元 | 患者突变c.827+1G>A (p.Ala276AlafsTer1)；分化试剂盒批次和培养时间（祖细胞诱导14天，中脑分化14天，成熟7天）；SA 500 μM 30 min，恢复120/150 min 阅读提示：Methods中Midbrain neurons differentiation及Figure legend图7 |
| 病理性SG诱导 | FUS WT、FUS-R521C或GR50质粒转染；转染后48 h检测；FUS阳性SG面积定量 阅读提示：Results中WDR45 deletion exacerbates accumulation of pathological SGs及Figure legend图6 |