ATP依赖的RNF213 E3活性体外验证
验证ATP结合是否激活RNF213 E3活性及区分结合与水解。
使用荧光偏振泛素化 assay、E2~Ub释放 assay 和ABP标记，测试WT及AAA3/AAA4突变体在不同核苷酸存在下的活性。
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ATP作为病原体相关分子模式激活E3泛素连接酶RNF213
ATP functions as a pathogen-associated molecular pattern to activate the E3 ubiquitin ligase RNF213.
实验完整度
高包含体外酶学、活细胞活性分析、冷冻电镜结构、质谱及突变验证等多层级证据
主要模型
T-REx-293RNF213 KO细胞系 THP-1单核细胞衍生的巨噬细胞 重组小鼠RNF213蛋白 UBE2L3~Ub和ABP探针
重点核对
ATP结合而非水解激活RNF213：WA3/WA4突变体活性降低，WB3/WB4突变体不受影响 ATPγS激活RNF213，ADP抑制，AMP不影响EC50 活细胞中2-DG降低ATP并下调RNF213活性，ATPγS共电转激活RNF213 IFN处理提高THP-1细胞ATP水平并激活RNF213，2-DG可逆转 Cys4462为催化半胱氨酸，His4483为通用碱基
摘要
巨型E3泛素连接酶RNF213是哺乳动物细胞自主免疫的保守组分，限制细菌、病毒和寄生虫的复制。为理解RNF213如何应对这些无关病原体，我们运用化学和结构生物学发现，ATP与其AAA核心结合可激活其E3功能。我们开发了在活细胞内进行全蛋白质组E3活性分析的方法，揭示RNF213的E3活性随细胞ATP丰度发生可逆转换。干扰素刺激巨噬细胞提高细胞内ATP水平并启动RNF213 E3活性，而糖酵解抑制则耗竭ATP并下调E3活性。这些数据提示ATP具有危险/病原体相关分子模式的标志，协调细胞自主防御。此外，用E3活性探针定量标记RNF213使我们能够识别底物泛素化所需的催化半胱氨酸，并获得RNF213-E2-泛素结合酶转移中间体的冷冻电镜结构，揭示了一个未标注的E2对接位点。总之，我们的数据表明RNF213代表一类新的ATP依赖性E3酶，采用独特的催化和调控机制以适应其在广泛防御细胞内病原体中的特殊作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RNF213如何被多样病原体感染调控，以及ATP是否作为PAMP/DAMP激活其E3活性。
- 核心机制
- ATP结合RNF213的AAA核心激活其E3活性，通过RZ结构域的Cys4462/His4483催化二联体进行转硫酯化，ADP抑制该激活。
- 主要证据
- 体外泛素化、E2~Ub释放、ABP标记、活细胞E3活性谱、质谱、冷冻电镜结构及突变分析。
- 研究意义
- 揭示RNF213为新型ATP依赖性E3酶，ATP作为危险/病原体相关分子模式协调细胞自主防御，并为E3活性谱分析提供方法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
活细胞内E3活性谱分析
在活细胞中检测RNF213 E3活性对ATP变化的响应。
通过电穿孔将生物素标记的E2~Ub ABP导入细胞，链霉亲和素富集后Western blot或质谱检测。
冷冻电镜结构解析
解析RNF213-E2~Ub转硫酯化中间体结构。
使用ABP共价交联的RNF213-UBE2L3~Ub复合物进行冷冻电镜数据收集和三维重构。
催化半胱氨酸鉴定
确定RNF213活性位点半胱氨酸。
通过XL-MS分析ABP交联位点，结合突变和活性 assay 验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
评估体内效果
结构解析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| E2 discharge assay | DyLight 488马来酰亚胺 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| DyLight 800马来酰亚胺 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Ni-NTA琼脂糖珠 | Qiagen | -- | |
| 醋酸纤维素离心柱 | Thermo Scientific | 69702 | |
| Superdex 75 Increase 3.2/300色谱柱 | Cytivia | -- | |
| 荧光偏振泛素化 assay | BSA单体 | Sigma Aldrich | A1900 |
| TCEP | VWR | 97064-848 | |
| 1536孔板 | Greiner Bio-One | 782900 | |
| UV透明封板膜 | Greiner, Merck | Z617571 | |
| PHERAstar FS酶标仪 | BMG Labtech | -- | |
| 活细胞E3活性谱分析 | Neon转染系统 | -- | -- |
| 链霉亲和素磁珠 | Pierce | -- | |
| Western blot | 抗RNF213抗体 | Merck | HPA026790 |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| 抗生物素-HRP | Cell Signaling Technology | 7075 | |
| 抗UBA1抗体 | Thermo Fisher | PA5-81869 | |
| 链霉亲和素蛋白，DyLight 680 | Thermo Fisher | 21848 | |
| 抗兔IgG-HRP | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| 抗兔DyLight 800 4xPEG偶联物 | Cell Signaling Technology | 5151 | |
| ATP检测 | 基于荧光素酶的ATP检测试剂盒 | Abcam | ab113849 |
| 细胞培养 | 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | Invivogen | -- |
| 干扰素α | PBL-Bioscience | -- | |
| MG132 | Merck | -- | |
| 2-脱氧葡萄糖 | Merck | -- | |
| 潮霉素B | Invivogen | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 质谱 | 测序级胰蛋白酶 | Promega | -- |
| 反相C18离心柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Acclaim Pepmap捕获柱 | Thermo Fisher Scientific | 164750 | |
| PepMap RSLC C18分析柱 | Thermo Fisher Scientific | ES903 | |
| Orbitrap Exploris 480质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 交联质谱 | Lys-C蛋白酶 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | -- |
| 胰蛋白酶 | Promega | V1651 | |
| Glu-C蛋白酶 | Promega | V1651 | |
| 金属结合 assay | 小体积10 mm石英比色皿 | Hellma ultra Micro, Sigma Aldrich | Z627062 |
| Denovix DS-11 FX+分光光度计 | Denovix | -- | |
| 冷冻电镜 | Titan Krios G3冷冻电镜 | -- | -- |
| Gatan BioQuantum能量过滤器 | Gatan | -- | |
| Gatan K3相机 | Gatan | -- | |
| 蛋白纯化 | Superdex 200 10/300 GL色谱柱 | Cytiva | -- |
| HiLoad 16/600 Superdex 200制备级色谱柱 | Cytiva | -- | |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 pg色谱柱 | Cytiva | -- | |
| Strep-Tactin琼脂糖树脂 | IBA Life Sciences | 12723074 | |
| 谷胱甘肽琼脂糖4B树脂 | -- | -- | |
| PreScission蛋白酶 | -- | -- | |
| 等温滴定量热法 | PEAQ-ITC量热仪 | Malvern Panalytical | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外E2~Ub释放 assay | E3浓度0.025 μM，E2~Ub浓度20 μM，核苷酸浓度1 mM，反应温度和时间 阅读提示：Methods 'E2 discharge assay' |
| 荧光偏振泛素化 assay | Ub 20 μM，E1 0.5 μM，E2 8 μM，E3 0.05 μM，反应温度30 °C，检测时间窗口10-30 min 阅读提示：Methods 'Fluorescence polarization-based ubiquitination assays' |
| 活细胞E3活性谱分析 | 电穿孔参数1400 V，20 ms，两次脉冲；ABP浓度1 mg/mL；ATPγS浓度25 mM；2-DG处理30 mM 3 h；IFN处理1000 U/mL过夜 阅读提示：Methods 'In cellula activity-based profiling of RNF213' |
| 冷冻电镜结构解析 | RNF213浓度1.5 μM，ABP浓度100 μM，ATPγS 5 mM，分辨率3.5 Å 阅读提示：Methods 'Preparation of RNF213-ABP for XL-MS' 和 Table 1 |
| ATP检测 | 细胞接种密度2×10^4 cells/well，2-DG处理30 mM 3 h，IFN处理过夜，发光检测 阅读提示：Methods 'Intracellular ATP measurements' |