全基因组CRISPR筛选鉴定耐药相关基因
识别BRAFV600E CRC对BRAFi±EGFRi耐药的关键基因
在HT-29细胞中进行全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选，分别用LGX818或LGX818+cetuximab处理14天，DMSO对照，通过二代测序分析sgRNA丰度
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靶向PLK1-CBX8-GPX4轴通过铁死亡克服BRAFV600E结直肠癌对BRAF/EGFR抑制剂的耐药性
Targeting PLK1-CBX8-GPX4 axis overcomes BRAF/EGFR inhibitor resistance in BRAFV600E colorectal cancer via ferroptosis.
实验完整度
高全基因组CRISPR筛选、蛋白质组学、体外细胞、类器官、异种移植和PDX模型，含功能与机制验证
主要模型
BRAFV600E结直肠癌细胞系HT-29和WiDr BRAFV600E CRC患者来源类器官 BRAFV600E CRC患者来源异种移植（PDX）模型 HT-29和WiDr皮下异种移植瘤模型
重点核对
CRISPR筛选：HT-29细胞，LGX818 1 μM或LGX818 100 nM + cetuximab 100 ng/ml处理14天，DMSO对照 细胞活力：HT-29和WiDr细胞，LGX818 1 μM或LGX818 100 nM + cetuximab 100 ng/ml，Onva 50 nM用于类器官 动物实验：LGX818 30 mg/kg口服每日，LGX818 10 mg/kg + cetuximab 5或10 mg/kg，RSL3 10 mg/kg腹腔每日，Onva 10 mg/kg口服每日，Fer-1 10 mg/kg腹腔每日 PDX模型：BRAFV600E突变患者来源肿瘤碎片皮下移植，siRNA 5 nmol/20 g每3天腹腔注射 铁死亡检测：ROS、脂质过氧化（Liperfluo、BODIPY-C11、4-HNE）、GSH、MDA、铁积累（PGSK）
摘要
转移性BRAFV600E结直肠癌（CRC）预后差，是治疗瓶颈。为识别BRAFV600E CRC中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的耐药机制，我们进行全基因组CRISPR-Cas9筛选，发现靶向谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）可克服BRAFV600E CRC对BRAF抑制剂（BRAFi）联合或不联合表皮生长因子受体抑制剂（EGFRi）的耐药性。具体而言，BRAFi±EGFRi上调GPX4表达，拮抗治疗诱导的铁死亡。此外，polo样激酶1（PLK1）底物激活促进PLK1转位至细胞核，激活 chromobox蛋白同源物8（CBX8）Ser265位点磷酸化，从而驱动GPX4表达。靶向PLK1增强BRAFi±EGFRi的抑制作用，并在体外、体内、类器官和患者来源异种移植模型中触发铁死亡。总之，我们证明PLK1–CBX8–GPX4信号轴传递治疗耐药的铁死亡机制，并提出一种临床可操作的策略以克服BRAFV600E CRC对BRAFi±EGFRi的耐药性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BRAFV600E结直肠癌对BRAF±EGFR抑制剂耐药的机制是什么，以及如何克服耐药？
- 核心机制
- BRAFi±EGFRi激活PLK1，PLK1转位入核并磷酸化CBX8 Ser265，促进CBX8转录上调GPX4表达，GPX4抑制铁死亡从而介导耐药；靶向PLK1可阻断该轴，诱导铁死亡并克服耐药。
- 主要证据
- 全基因组CRISPR筛选发现GPX4敲除与BRAFi±EGFRi合成致死；蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学鉴定GPX4上调及CBX8 Ser265磷酸化；PLK1与CBX8相互作用及磷酸化验证；GPX4启动子结合和转录调控；体外细胞、类器官、异种移植和PDX模型证明靶向PLK1联合BRAFi±EGFRi通过铁死亡增强抗肿瘤效果。
- 研究意义
- 提出在BRAFV600E结直肠癌中联合PLK1抑制剂与BRAF±EGFR抑制剂是一种临床可操作的策略，通过诱导铁死亡克服治疗耐药。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证GPX4在耐药中的作用
验证GPX4表达变化及其对BRAFi±EGFRi敏感性的影响
蛋白质组学检测HT-29细胞经LGX818±cetuximab处理后的蛋白变化；Western blot和RT-qPCR检测GPX4表达；GPX4敲低联合BRAFi±EGFRi的细胞活力、克隆形成和铁死亡指标检测；RSL3联合处理；体内异种移植模型检测肿瘤生长和4-HNE表达
鉴定GPX4上游转录因子CBX8
寻找调控GPX4表达的转录因子并验证其功能
4D-LFQ磷酸化蛋白质组学分析LGX818±cetuximab处理的HT-29细胞；hTFtarget数据库预测GPX4转录因子；siRNA敲低候选转录因子筛选GPX4调节因子；CBX8敲低对GPX4表达和铁死亡的影响；双荧光素酶报告基因和ChIP-qPCR验证CBX8结合GPX4启动子；PDX模型验证靶向CBX8联合治疗
鉴定PLK1为CBX8上游激酶并验证磷酸化
确定磷酸化CBX8的激酶及其调控机制
Flag-CBX8免疫沉淀结合质谱鉴定互作蛋白；内源性Co-IP和体外pull-down验证PLK1与CBX8相互作用；PLK1敲低或抑制剂Onva处理检测CBX8 Ser265磷酸化；体外激酶实验检测PLK1磷酸化CBX8；免疫荧光检测PLK1核转位；构建CBX8 S265A/S265D突变体验证功能
验证靶向PLK1联合BRAFi±EGFRi通过铁死亡抑制肿瘤
评估PLK1抑制剂联合BRAFi±EGFRi的抗肿瘤效果及铁死亡机制
PLK1敲低联合BRAFi±EGFRi的细胞活力、铁死亡指标检测；Onva联合LGX818±cetuximab在细胞、类器官和PDX模型中的效果；铁死亡抑制剂Fer-1/Lip-1 rescue实验；GPX4过表达rescue实验；细胞周期分析；体内异种移植模型和PDX模型验证肿瘤生长抑制及毒性
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CRISPR筛选 | 慢病毒人CRISPR敲除文库 | Zhang laboratory | -- |
| 嘌呤霉素 | TargetMol | -- | |
| DNA提取试剂盒 | Omega | D3396 | |
| HiSeq 2000测序仪 | Illumina | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 药物处理 | 恩考拉非尼 | TargetMol | T6487 |
| 西妥昔单抗 | TargetMol | T9905 | |
| Ferrostatin-1 | TargetMol | T6500 | |
| Liproxstatin-1 | TargetMol | T2376 | |
| RSL3 | TargetMol | T3646 | |
| 达拉非尼 | TargetMol | T1903 | |
| 维莫非尼 | TargetMol | T2382 | |
| 吉非替尼 | TargetMol | T1181 | |
| Onvansertib | Selleck | S7255 | |
| 质粒转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取与qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | SYBR Green试剂盒 | Takara | RR420A |
| Bio-Rad CFX96实时定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Promega | -- |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- | |
| 化学发光试剂 | Beyotime | -- | |
| 免疫荧光 | 免疫染色封闭液 | Beyotime | P0260 |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Beyotime | P0126 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8细胞活力检测试剂盒 | GLPBIO | ECK08 |
| 细胞周期分析 | RNase A溶液 | ELGBIO | ERS0028 |
| 脂质过氧化检测 | 丙二醛检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | S0131S |
| 谷胱甘肽检测 | 谷胱甘肽检测试剂盒 | Solarbio | BC1175 |
| 脂质过氧化检测 | Liperfluo脂质过氧化探针 | DOJINDO | L248 |
| 铁检测 | Phen Green SK铁荧光探针 | Thermo Fisher Scientific | P-14313 |
| 脂质过氧化检测 | BODIPY 581/591 C11脂质过氧化探针 | MK Bio | MX5211 |
| 蛋白质组学 | Q-Exactive Orbitrap质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Easy-NLC 1200纳升液相色谱平台 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | BesTest | -- |
| NDG小鼠 | BesTest | -- | |
| PDX实验 | CBX8 siRNA | RiboBio | -- |
| PLK1 siRNA | RiboBio | -- | |
| 类器官培养 | 基质胶 | -- | -- |
| Advanced DMEM/F-12培养基 | Gibco | -- | |
| I型胶原酶 | Worthington | -- | |
| 透明质酸酶 | Worthington | -- | |
| Dispase II | Gibco | -- | |
| GlutaMax添加剂 | Gibco | -- | |
| HEPES缓冲液 | Gibco | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR筛选 | 细胞系HT-29、文库hGeCKOv2、感染复数0.3、嘌呤霉素10 μg/ml筛选3天、LGX818 1 μM或LGX818 100 nM + cetuximab 100 ng/ml处理14天、DMSO对照 阅读提示：Methods中CRISPR screening小节及Fig. 1a-c图注 |
| 药物处理与细胞活力 | 细胞系HT-29、WiDr等，LGX818 1 μM或LGX818 100 nM + cetuximab 100 ng/ml，处理48小时，Onva浓度梯度，RSL3浓度梯度 阅读提示：Methods中Cell viability and colony formation assays小节及Fig. 2a-b、Fig. 6b图注 |
| 动物实验 | 小鼠品系BALB/c或NDG、4周龄雌性、细胞接种量5×10^6、给药剂量LGX818 30 mg/kg或10 mg/kg、cetuximab 5或10 mg/kg、RSL3 10 mg/kg、Onva 10 mg/kg、Fer-1 10 mg/kg、给药途径和周期21天、每组n=5或8 阅读提示：Methods中Animal experiments小节及Fig. 2e、Fig. 7e图注 |
| PDX实验 | 患者来源BRAFV600E突变肿瘤碎片2-3 mm3、NCG小鼠6周龄雄性、siRNA 5 nmol/20 g每3天腹腔注射、给药剂量LGX818 30 mg/kg或10 mg/kg + cetuximab 5 mg/kg、Fer-1 10 mg/kg、每组n=5 阅读提示：Methods中PDX experiments小节及Fig. 4h、Fig. 6a、Fig. 7g图注 |
| 类器官实验 | 患者来源BRAFV600E突变CRC组织、Onva 50 nM、LGX818 1 μM或100 nM + cetuximab 100 ng/ml、处理4天 阅读提示：Methods中Patient-derived organoid小节及Fig. 6c-g图注 |
| 铁死亡指标检测 | Liperfluo 10 μM孵育1小时、BODIPY 581/591 C11 10 μM孵育1小时、Phen Green SK 5 μmol/L孵育30分钟（细胞）或1小时（类器官）、MDA和GSH试剂盒按说明书 阅读提示：Methods中Assessment of lipid peroxidation、Iron assay、Malondialdehyde assay、Glutathione assay小节 |