动物创面模型验证FMOD促肌成纤维细胞清除
验证FMOD在体内是否减少肌成纤维细胞并促进其凋亡。
在小鼠、大鼠和猪皮肤创面模型中注射FMOD，通过IHC检测α-SMA和cleaved caspase-3，量化肌成纤维细胞密度和凋亡细胞密度。
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纤维调节蛋白通过增强白细胞介素1β信号通路选择性加速皮肤创面肌成纤维细胞凋亡
Fibromodulin selectively accelerates myofibroblast apoptosis in cutaneous wounds by enhancing interleukin 1β signaling.
实验完整度
高包含小鼠、大鼠、猪三种动物模型及多种人源细胞体外实验，涵盖功能验证与IL1β信号机制验证。
主要模型
成年Fmod-/-与野生型小鼠皮肤创面模型 成年Sprague-Dawley大鼠皮肤创面模型 雌性红杜洛克猪过度机械负荷创面模型 人源皮肤成纤维细胞及瘢痕疙瘩/增生性瘢痕来源成纤维细胞
重点核对
动物模型：小鼠、大鼠、猪的品系、性别、年龄及创面制作方式 FMOD给药：剂量0.4 mg/μL（小鼠/大鼠）或2.0 mg/μL（猪），创缘注射，总体积50 μL或200 μL/创面 体外肌成纤维细胞转化：TGFβ1浓度2.5 ng/mL（大鼠）或5.0 ng/mL（人），处理时间4天或6天 凋亡诱导处理：IL1β 2 ng/mL ± TGFβ1 2.5 ng/mL ± FMOD 12 μg/mL，处理48小时 流式细胞术凋亡门控：Annexin V+/PI−为凋亡，Annexin V+/PI+为焦亡
摘要
活化的肌成纤维细胞沉积细胞外基质以促进快速创面闭合，在胎儿发育过程中可实现无瘢痕愈合。然而，成人肌成纤维细胞寿命较长且功能持续，导致瘢痕形成。因此，了解胎儿与成人组织再生差异可能有助于识别促进成人更优创面愈合且瘢痕更少的因子。我们此前发现基质细胞蛋白聚糖纤维调节蛋白是促进更优修复的此类因子之一，但其潜在分子和细胞机制尚未完全阐明。在此，我们发现纤维调节蛋白在小型和大型动物模型中诱导创面闭合后肌成纤维细胞凋亡以减少瘢痕。机制上，纤维调节蛋白加速并延长白细胞介素1β-白细胞介素1受体1型-白细胞介素1受体辅助蛋白三元复合物的形成，以增加肌成纤维细胞以及瘢痕疙瘩和增生性瘢痕来源细胞的凋亡。由于组织再生过程中肌成纤维细胞的持续存在是大多数器官纤维化的关键原因，纤维调节蛋白代表了一种有前景的广谱抗纤维化治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 纤维调节蛋白是否以及如何促进成人创面闭合后肌成纤维细胞的清除以减少瘢痕形成？
- 核心机制
- FMOD结合IL1R1和IL1RAP，加速并延长IL1β-IL1R1-IL1RAP三元复合物形成，增强IL1β自分泌信号，从而选择性诱导肌成纤维细胞凋亡。
- 主要证据
- 在小鼠、大鼠和猪创面模型中，FMOD减少α-SMA+肌成纤维细胞密度并增加cleaved caspase-3+细胞；体外FMOD选择性诱导RDF、BJ、NHDF转化肌成纤维细胞及瘢痕疙瘩/HS来源成纤维细胞凋亡；IL1B敲低或敲除、IL1R1/IL1RAP敲低、rhein和IL-1Ra均阻断FMOD促凋亡作用；pull-down和SPR证实FMOD与IL1R1/IL1RAP及三元复合物结合。
- 研究意义
- FMOD通过模拟胎儿创面无瘢痕愈合中的肌成纤维细胞快速清除，为减少皮肤瘢痕及治疗其他器官纤维化提供了广谱抗纤维化治疗策略的潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证FMOD选择性诱导肌成纤维细胞凋亡
明确FMOD是否选择性作用于活化的肌成纤维细胞而非未转化成纤维细胞。
用TGFβ1将RDF、BJ、NHDF及瘢痕疙瘩/HS来源成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，以IL1β为阳性对照，FMOD处理48小时后通过流式细胞术（Annexin V/PI）、TUNEL和cleaved caspase-3检测凋亡与焦亡。
验证内源性IL1β信号在FMOD促凋亡中的必要性
确定FMOD促肌成纤维细胞凋亡是否依赖内源性IL1β及其受体信号。
利用CRISPR/Cas9敲除BJ成纤维细胞IL1B，并用siRNA敲低IL1B、IL1R1或IL1RAP，或用rhein、IL-1Ra抑制IL1β信号，检测FMOD诱导的IL1β产生和肌成纤维细胞凋亡。
解析FMOD与IL1β三元复合物的结合及促进作用
明确FMOD是否直接结合IL1β-IL1R1-IL1RAP复合物并促进其组装。
采用pull-down、SPR、分子对接和邻近连接 assay（PLA）检测FMOD与IL1β、IL1R1、IL1RAP的相互作用及对复合物形成的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| FMOD生产 | pSecTag2A载体 | Life Technology | -- |
| Freestyle CHO表达培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| HiTrap IMAC HP 1 mL柱 | GE Healthcare | -- | |
| HiTrap Q HP 1 mL柱 | GE Healthcare | -- | |
| 免疫组织化学 | 小鼠抗α-SMA抗体[4A4] | GeneTex | GTX60466 |
| 兔抗cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | #9661 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP试剂盒 | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| FGM成纤维细胞生长培养基BulletKit | Lonza | -- | |
| 转化生长因子β1 | MilliporeSigma | -- | |
| 细胞凋亡诱导 | 重组大鼠IL1β | MilliporeSigma | -- |
| 重组人IL1β | PeproTech | -- | |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC/PI死细胞凋亡检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Annexin V-APC偶联物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TUNEL | 原位细胞死亡检测试剂盒，荧光素 | Roche Applied Science | -- |
| ELISA | ELISA MAX Deluxe Set人IL-1β试剂盒 | BioLegend | -- |
| Western blot | 山羊抗人IL-1β/IL-1F2抗体 | R&D systems | AF-201-NA |
| 兔抗GAPDH抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA1-987 | |
| RNAi | Silencer Select阴性对照siRNA | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 抑制剂处理 | 大黄酸 | Abcam | -- |
| IL-1受体拮抗剂 | ProSpec LLc | -- | |
| Pull-down | Pierce His蛋白相互作用Pull-down试剂盒 | Pierce | -- |
| 重组人IL1β | R&D Systems | 201-LB-010/CF | |
| 重组人IL1R1 | R&D Systems | 269-1R-100/CF | |
| 重组人IL1RAP | R&D Systems | 676-CP-100/CF | |
| 兔抗纤维调节蛋白抗体(H50) | Santa Cruz Biotechnology | sc-33772 | |
| 兔抗IL1受体I抗体 | Abcam | ab154524 | |
| 小鼠抗IL-1RAcP (D5)抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376872 | |
| SPR | Biacore 3000生物分子相互作用分析仪 | Biacore AB | -- |
| CM5传感器芯片 | GE Healthcare | -- | |
| 邻近连接实验 | Duolink原位PLA实验 | MilliporeSigma | -- |
| Duolink流式PLA检测试剂盒-绿色 | MilliporeSigma | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物创面模型与FMOD给药 | 动物品系、性别、年龄/体重；创面大小与深度；FMOD浓度（小鼠/大鼠0.4 mg/μL，猪2.0 mg/μL）和注射体积；取材时间点（小鼠14天、大鼠2周、猪8周） 阅读提示：Methods中Adult mouse/rat skin wound model及Excessive-mechanical-loading porcine wound model小节 |
| 体外肌成纤维细胞转化 | TGFβ1浓度（RDF 2.5 ng/mL，人细胞5.0 ng/mL）、处理频率（每日）和持续时间（4天或6天）；转化确认指标（α-SMA表达） 阅读提示：Methods中RDF及Human dermal fibroblast maintenance and fibroblast-to-myofibroblast conversion小节 |
| 凋亡诱导与检测 | IL1β 2 ng/mL、TGFβ1 2.5 ng/mL、FMOD 12 μg/mL；处理48小时；血清饥饿16小时；流式细胞术门控（Annexin V+/PI−为凋亡，Annexin V+/PI+为焦亡） 阅读提示：Methods中Cell apoptosis induction及Flow cytometry小节 |
| IL1B敲除与RNAi | CRISPR/Cas9 gRNA序列与转染MOI；嘌呤霉素筛选浓度1.5 μg/mL；siRNA转染后48小时检测；敲除验证方法（LPS刺激后IL1β分泌） 阅读提示：Methods中Generation of IL1B-knockout BJ fibroblasts及RNAi小节 |
| FMOD与三元复合物结合实验 | Pull-down中FMOD与猎物蛋白用量；SPR中FMOD固定于CM5芯片、IL1R1/IL1RAP浓度与流速；PLA中一抗浓度与处理时间点（1–72小时） 阅读提示：Methods中Pull-down assay、SPR analysis及In situ PLA小节 |