SOX9+生骨节祖细胞的诱导与分选
从hPSC高效获得具有骨软骨分化能力的SOX9+生骨节祖细胞。
采用优化法经原条、前体节中胚层，跳过体节阶段，用SAG激活SHH并抑制BMP/WNT，诱导SOX9+细胞，并通过流式分选或ITGA9分选获取。
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hPSC来源的SOX9+生骨节祖细胞重现软骨内成骨
Recapitulation of endochondral ossification by hPSC-derived SOX9+ sclerotomal progenitors.
实验完整度
高包含体外分化、小鼠皮下/肾囊移植、单细胞测序和力学测试等多层级验证，并涉及功能与机制。
主要模型
SOX9-tdTomato UC01 hiPSCs NOD-SCID小鼠皮下移植模型 NOD-SCID小鼠肾囊膜下移植模型 NOD-SCID小鼠关节软骨缺损修复模型
重点核对
SOX9+ scl-progenitors分化效率：优化法平均99.21% ± 0.24%，传统法约82.01% 微团培养诱导早期软骨细胞：BMP2 100 ng/ml + SAG，培养12天 体内移植：NOD-SCID小鼠皮下注射或肾囊膜下移植，4、8、16周取材分析 生长板样结构构建：成骨球与软骨球1:1融合，体外培养7天后肾囊膜下移植4周 ITGA9分选验证：抗人ITGA9抗体分选后，ITGA9+细胞富集生骨节标志物并具骨软骨分化能力
摘要
软骨内成骨是大多数承重骨的形成方式，在人类细胞中重现这一过程仍具挑战。本文报道从人多能干细胞（hPSC）中生成SOX9+生骨节祖细胞（scl-progenitors），即一种处于前凝聚阶段的间充质前体，并开发了针对这些细胞的骨软骨诱导方法。经谱系特异性诱导后，SOX9+生骨节祖细胞不仅生成关节软骨，还经历了自发凝聚、软骨原基形成、软骨细胞肥大、血管侵入，并最终形成带有基质的骨组织，从而重现了软骨内成骨的关键阶段。此外，利用SOX9+生骨节祖细胞来源的软骨球与成骨球融合构建物，还诱导出了自组织的生长板样结构，其分子和细胞特征与原生生长板相似。进一步，我们鉴定出ITGA9作为SOX9+生骨节祖细胞的特异性表面标志物，可实现不依赖报告基因的分离，并建立了支持其扩增的培养体系。本研究突显了SOX9+生骨节祖细胞作为模拟人类骨骼发育及骨/软骨生物工程的有力工具。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否利用hPSC来源的SOX9+生骨节祖细胞在体外和体内重现人软骨内成骨的关键阶段并形成生长板样结构？
- 核心机制
- SOX9+生骨节祖细胞是处于前凝聚阶段的生骨节祖细胞，经谱系特异性诱导可分化为软骨祖细胞或成骨定向早期软骨细胞，后者在体内自发经历凝聚、软骨原基形成、软骨细胞肥大、血管侵入和骨形成，并形成生长板样结构。
- 主要证据
- 体外分化结合RT-qPCR、免疫染色、流式细胞术证实SOX9+ scl-progenitors的骨软骨分化能力；小鼠皮下和肾囊膜下移植显示4、8、16周逐渐形成软骨、肥大、血管侵入、骨和骨髓腔；单细胞RNA测序和力学测试表明生长板样结构与原生长板相似并具功能。
- 研究意义
- 为模拟人类骨骼发育、研究软骨内成骨相关疾病机制以及骨/软骨生物工程提供了有前景的工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SOX9+生骨节祖细胞的体外扩增
建立支持SOX9+生骨节祖细胞长期扩增的培养体系。
在CDMi基础培养基中添加SAG、LDN193189、Y27632、bFGF、KSR和BSA进行扩增培养。
成骨定向早期软骨细胞的微团诱导
诱导SOX9+生骨节祖细胞自发凝聚并分化为成骨定向早期软骨细胞，模拟软骨内成骨早期阶段。
将SOX9+生骨节祖细胞以微团培养，使用高剂量BMP2联合SAG诱导12天，检测凝聚和早期软骨标志物。
体内移植验证软骨内成骨过程
验证微团来源早期软骨细胞在体内能否自发经历肥大、血管侵入和骨形成。
将微团来源细胞皮下注射到NOD-SCID小鼠，分别于4、8、16周取材，进行组织学和免疫染色分析。
软骨球与成骨球融合构建生长板样结构
通过构建软骨-成骨界面，诱导极性生长板样结构形成。
将SOX9+生骨节祖细胞来源的成骨球（微团来源早期软骨细胞成球）与软骨球（day-14软骨祖细胞成球）按1:1离心融合，体外培养7天后移植到肾囊膜下，4周后分析。
生长板样结构的功能与分子特征验证
验证生长板样结构是否具有纵向生长功能和分子细胞相似性。
测量融合构建物体积和长度变化，纳米压痕测试力学性能，单细胞RNA测序并与胚胎长骨数据比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 多能性生长培养基1 | Cellapy | CA1007500 |
| 基质胶 | Corning | 354230 | |
| DMEM/F12培养基 | Gibco | C11330500 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco | C10010500BT | |
| MEM α培养基 | Gibco | 12571063 | |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH30084.03 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 0.25%胰蛋白酶-EDTA | Thermofisher | 25200056 | |
| 基因编辑 | Lipofectamine Stem转染试剂 | ThermoFisher | STEM00015 |
| Accutase细胞消化液 | Innovative Cell Technologies | AT-104 | |
| Y27632 | MCE | HY-10071 | |
| 分化诱导 | IMDM培养基 | Gibco | 31980-097 |
| F12培养基 | Gibco | 31765-092 | |
| 浓缩脂质 | Gibco | 11905-031 | |
| 单硫代甘油 | Sigma | M6145 | |
| 胰岛素 | Solarbio | I8830 | |
| 转铁蛋白 | Sigma | T0665 | |
| 聚乙烯醇 | Sigma | P8136-250G | |
| Activin A | Solarbio | P00101 | |
| CHIR99021 | MCE | HY-10182 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Peprotech | 100-18B | |
| SB431542 | MCE | HY-10431 | |
| LDN193189 | MCE | HY-12071A | |
| PD0325901 | MCE | HY-10254 | |
| SAG | MCE | HY-12848 | |
| XAV939 | MCE | HY-15147 | |
| TrypLE消化液 | Gibco | 12605028 | |
| RT-qPCR | TRI试剂 | Sigma-Aldrich | T9424 |
| PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | TAKARA | RR047A | |
| AceQ Universal SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q511-02 | |
| 免疫染色 | 牛血清白蛋白 | Sigma | A3311-10G |
| 含DAPI封片剂 | ZSJB-BIO | ZLI-9557 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Thermo Fisher | 89901 |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | 23227 | |
| PVDF膜 | Thermo Fisher | 88518 | |
| ECL化学发光底物 | Affinity | KF8005 | |
| 流式细胞术 | 布雷非德菌素A | -- | -- |
| 软骨诱导 | 地塞米松 | MCE | HY-14648 |
| 抗坏血酸 | Sigma | A8960 | |
| L-脯氨酸 | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| 转化生长因子β3 | Peprotech | 100-36E | |
| 骨形态发生蛋白2 | Peprotech | 120-02 | |
| ITS+1添加剂 | Sigma-Aldrich | 12521-5ML | |
| 成骨诱导 | β-甘油磷酸 | Millipore | 35675 |
| 组织学染色 | 阿尔新蓝8GX | Sigma | A5268-100G |
| Wiegert苏木素 | Solarbio | G1371 | |
| 固绿FCF | Sigma-Aldrich | F7252-100G | |
| 番红O | Sigma | S2255-100G | |
| 甲苯胺蓝O | Solarbio | G2543 | |
| 胃蛋白酶 | Sigma-Aldrich | R2283 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
| 通用免疫组化染色试剂盒 | ZSJB-BIO | PV6000 | |
| 茜素红 | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Masson三色染色试剂盒 | Solarbio | G1346 | |
| 油红O | Solarbio | G1260 | |
| RNAscope | 探针Mm-Pax9-C2 | ACDbio | 454321-C2 |
| Opal 690试剂 | Asbio | ASOP690 | |
| 动物实验 | 阿佛丁 | Sigma-Aldrich | T48402 |
| I型胶原-基质胶混合物 | Advanced Biomatrix | 5005 | |
| MEM（10×） | Gibco | 11430030 | |
| DMEM培养基 | Gibco | 11965092 | |
| 胰岛素注射器 | BD | 324903 | |
| 组织切片 | OCT包埋剂 | SAKURA | 4583 |
| 组织透明化 | 肉桂酸乙酯 | Sigma | 112372 |
| 聚乙二醇 | Sigma | 447943 | |
| 单细胞RNA测序 | TotalSeq-A0251抗人Hashtag 1 | Biolegend | 394601 |
| TotalSeq-A0252抗人Hashtag 2 | Biolegend | 394603 | |
| TotalSeq-A0253抗人Hashtag 3 | Biolegend | 394605 | |
| TotalSeq-A0254抗人Hashtag 4 | Biolegend | 394607 | |
| LiberaseTM | Roche | 5401127001 | |
| 红细胞裂解液 | Beyotime | C3702-500ml | |
| 力学测试 | 纳米压痕仪 | Bruker | TI-950 |
| Berkovich压头 | Bruker | TI0039 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SOX9+生骨节祖细胞诱导 | PS/PSM诱导因子浓度与时间；生骨节诱导SAG 200 nM、LDN193189 600 nM、XAV939 0.5 μM、Y27632 10 μM；接种密度1×10^5 cells/cm2；分化效率99.21% ± 0.24% 阅读提示：Methods 'Generation of SOX9+ sclerotomal progenitors (scl-progenitors)'及Fig. 1A |
| SOX9+生骨节祖细胞扩增 | 扩增培养基成分：SAG 200 nM、LDN193189 600 nM、Y27632 10 μM、bFGF 10 ng/ml、1% KSR、5 mg/ml BSA；接种密度1×10^5 cells/cm2；扩增时间约2个月/15代 阅读提示：Methods 'Expansion culture of SOX9+ scl-progenitors'及Fig. 1G |
| 成骨定向早期软骨细胞微团诱导 | 微团接种2×10^5细胞/5 μl；诱导培养基CDMi + SAG 200 nM + BMP2 100 ng/ml + 1% KSR；诱导12天，每天换液 阅读提示：Methods 'Derivation of osteogenesis-committed early chondrocytes in micromass culture'及Fig. 2A |
| 体内移植（皮下/肾囊膜下） | 动物：8周龄雄性NOD-SCID小鼠；皮下注射每微团70 μl Matrigel；肾囊膜下移植；取材时间点4、8、16周 阅读提示：Methods 'Subcutaneous injection of micromass-derived early chondrocytes'和'Transplantation of SOX9+ scl-progenitors under renal capsule' |
| 软骨球与成骨球融合构建 | 成骨球：微团来源早期软骨细胞离心成球，CI培养基培养7天；软骨球：1×10^5 SOX9+生骨节祖细胞离心成球，CI培养基培养14天；融合比例1:1；移植肾囊膜下4周 阅读提示：Methods 'Construction of osteochondral fusions'及Fig. 4A |
| 生长板样结构功能评估 | 生长测量：每周测量共4周，n=3-6；纳米压痕：4周融合构建物，峰值力100 μN（R/PZ和HZ）或10 mN（海绵骨）；scRNA-seq：4周构建物，10x Genomics平台，3个移植体混合 阅读提示：Methods 'Mechanical assessment of osteochondral fusions by nanoindentation'和'Single-cell RNA sequencing'及Fig. 5 |