中年小鼠肥胖易感性及WAT功能改变验证
验证中年小鼠在高脂饮食下更易肥胖，并确定WAT是主要功能改变器官。
3月龄和12月龄小鼠分别给予标准饮食或HFD 4周，检测体重、GTT、ITT、能量代谢、脂肪组织巨噬细胞亚群和炎症因子；分析公共RNA-seq数据及人/鼠WAT、肝脏、骨骼肌的代谢标志物。
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脂肪祖细胞来源的细胞外囊泡通过抑制巨噬细胞M1程序缓解中年肥胖
Adipose progenitor cell-derived extracellular vesicles suppress macrophage M1 program to alleviate midlife obesity.
实验完整度
高包含人/鼠组织snRNA-seq、体外BMDM/ATM功能验证、机制通路验证及中年小鼠体内干预实验
主要模型
3月龄与12月龄C57BL/6小鼠 人白色脂肪组织样本 骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） 脂肪组织巨噬细胞（ATMs）
重点核对
小鼠年龄：年轻3月龄，中年12月龄 HFD喂养4周，EVs每周静脉注射30 μg miR-145@tar-lip静脉注射1 mg miRNA/kg体重，每3天一次 LPS 100 ng/mL诱导M1极化，EVs 50 ng/mL预处理24 h BMDMs中miR-145 mimics 50 nM，inhibitor 100 nM
摘要
在不同年龄组中，中年个体尤其易患肥胖，其全因死亡风险高出22%。然而，其潜在机制尚不清楚。在本研究中，我们发现中年受试者白色脂肪组织（WAT）中的脂肪祖细胞（APCs）是中年肥胖的潜在原因。具体而言，APCs来源的细胞外囊泡（EVs）在中年个体中减轻脂肪组织巨噬细胞（ATMs）炎性衰老的能力受损。机制上，这些EVs缺乏miR-145-5p，无法抑制ATMs中L-选择素的表达，从而通过NF-κB信号通路促进其M1程序。相反，来自年轻APCs的EVs有效抑制M1巨噬细胞极化。据此，我们设计了靶向脂质体将miR-145-5p模拟物递送至ATMs，可有效预防中年小鼠肥胖。总之，我们的发现强调了APC来源的EVs在中年肥胖中的作用，并提出miR-145-5p作为临床应用的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 中年个体易患肥胖的机制是否涉及脂肪祖细胞来源的细胞外囊泡及其内容物对脂肪组织巨噬细胞极化的调控。
- 核心机制
- 中年APCs来源EVs中miR-145减少，导致其对ATMs中SELL（L-选择素）的抑制减弱，进而激活NF-κB信号通路，促进巨噬细胞M1程序；补充miR-145可抑制SELL–NF-κB轴。
- 主要证据
- 人/鼠WAT的snRNA-seq和bulk RNA-seq、BMDMs和ATMs的体外极化实验、miR-145 mimics/inhibitor和Sell siRNA/过表达 rescue 实验、荧光素酶报告基因验证SELL为miR-145靶点、以及中年小鼠HFD模型中yEVs和miR-145@tar-lip的体内保护效果。
- 研究意义
- 揭示APC来源EVs在中年肥胖风险中的作用，并提出miR-145作为中年肥胖预防和治疗的潜在靶点；靶向脂质体递送策略在临床应用中具有潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
APCs衰老表型及EVs功能分析
确定中年APCs的衰老表型及其来源EVs对巨噬细胞M1程序的调控能力。
分离人/鼠APCs，检测衰老标志物和SASP；收集APCs培养上清提取EVs，鉴定EVs形态、粒径和标志物；用PKH26/DiI标记EVs检测巨噬细胞摄取；用yEVs或mEVs预处理BMDMs后LPS刺激，检测M1标志物。
APC来源EVs体内干预中年小鼠肥胖
验证yEVs与mEVs对中年小鼠HFD诱导肥胖和WAT炎症的体内效果差异。
12月龄小鼠HFD 4周，每周静脉注射PBS、yEVs或mEVs（30 μg），检测体重、能量代谢、GTT/ITT、WAT质量、CLS、巨噬细胞亚群、炎症因子和衰老标志物。
miR-145鉴定及其对巨噬细胞M1程序的调控
筛选yEVs和mEVs差异miRNA，验证miR-145对巨噬细胞M1极化的作用及yEVs效应依赖性。
对yEVs和mEVs进行miRNA测序，RT-qPCR验证候选miRNA；在BMDMs中转染miR-145 mimics或inhibitor，LPS刺激后检测M1标志物和炎症因子；用miR-145 inhibitor联合yEVs进行rescue实验。
SELL–NF-κB机制验证
验证miR-145通过靶向SELL抑制NF-κB信号通路，进而抑制巨噬细胞M1程序。
对miR-145 mimics处理的M1巨噬细胞进行bulk RNA-seq，结合TargetScan预测靶基因；荧光素酶报告基因验证miR-145与Sell 3’UTR结合；Sell siRNA和腺病毒过表达进行功能rescue；Western blot检测NF-κB通路。
靶向脂质体构建及体内递送验证
构建靶向ATMs的阳离子脂质体递送miR-145 mimics，并评估其体内靶向性和治疗效果。
合成CKGGRAKDC肽修饰的阳离子脂质体装载miR-145 mimics，表征粒径、电位、包封率；DiR标记后IVIS追踪体内分布；12月龄小鼠HFD 4周，每3天静脉注射PBS、NC miR@tar-lip、miR-145@lip或miR-145@tar-lip，检测肥胖表型和WAT炎症。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | eBioscience | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | L3000015 | |
| miRNA转染 | miR-145模拟物 | Ribobio | -- |
| miR-145抑制剂 | Ribobio | -- | |
| siRNA转染 | Sell siRNA | Ribobio | -- |
| 腺病毒转导 | Sell腺病毒 | DesignGene Biotechnology | -- |
| NF-κB激活 | CU-T12-9 | Selleck | S2979 |
| 流式细胞术 | PE抗小鼠F4/80抗体 | Biolegend | 123110 |
| FITC抗小鼠CD11b抗体 | Biolegend | 101206 | |
| APC抗小鼠CD11c抗体 | Biolegend | 117310 | |
| PE/Cy7抗小鼠CD206抗体 | Biolegend | 141720 | |
| APC抗小鼠CD31抗体 | Biolegend | 102410 | |
| APC抗小鼠CD45抗体 | Biolegend | 103112 | |
| Western blot | 磷酸化AKT Ser473抗体 | CST | 4060s |
| AKT抗体 | CST | 4685s | |
| iNOS抗体 | CST | 13120S | |
| CD62L/L-选择素兔多克隆抗体 | Abclonal | A1622 | |
| TSG101抗体 | Abcam | ab125011 | |
| CD63抗体 | Abcam | ab134045 | |
| 钙联蛋白抗体 | Abcam | ab22595 | |
| 磷酸化NF-κB p65 (Ser536)抗体 | CST | 3033s | |
| NF-κB p65抗体 | CST | 8242s | |
| 磷酸化IκBα抗体 | CST | 2859 | |
| IκBα抗体 | CST | 9242 | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Takara | 9109 |
| cDNA合成试剂盒 | Vazyme | R223-01 | |
| SYBR qPCR预混液 | Yeasen | 11203 | |
| miRNA RT-qPCR | Bulge-Loop miRNA qRT-PCR起始试剂盒 | Ribobio | C10211-1 |
| ELISA | TNF-α ELISA试剂盒 | Biolegend | 430904 |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Biolegend | 431304 | |
| IL-1β ELISA试剂盒 | Biolegend | 432604 | |
| EVs标记 | DiI荧光染料 | Beyotime | C1036 |
| DiO荧光染料 | Beyotime | C1038 | |
| DiR荧光染料 | MedChemExpress | 100068-60-8 | |
| PKH26染色液 | MedChemExpress | 154214-55-8 | |
| β-Gal染色 | 细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Beyotime | C0602 |
| 免疫荧光 | F4/80抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-377009 |
| Perplin2抗体 | Abclonal | A6276 | |
| 白蛋白抗体 | Abclonal | A1363 | |
| 层粘连蛋白受体抗体 | Abclonal | A5968 | |
| Alexa Fluor 488抗小鼠二抗 | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | |
| Alexa Fluor 594抗兔二抗 | Jackson ImmunoResearch | 111-585-003 | |
| Alexa Fluor 488抗兔二抗 | Jackson ImmunoResearch | 111-545-003 | |
| DAPI | Servicebio | G1012 | |
| 组织消化 | I型胶原酶 | -- | -- |
| APCs分离 | CD45磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-045-801 |
| CD31磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| CD34磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | |
| 小鼠APCs分离 | 非脂肪组织祖细胞磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-106-639 |
| 脂肪组织祖细胞磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-106-639 | |
| ATMs分离 | CD11b磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-049-601 |
| 脂质体构建 | C12-200脂质 | -- | -- |
| 二硬脂酰磷脂酰胆碱 | -- | -- | |
| 甲氧基聚乙二醇-二肉豆蔻酰甘油 | -- | -- | |
| 马来酰亚胺聚乙二醇-二肉豆蔻酰甘油 | -- | -- | |
| 活体成像 | IVIS Lumina XR活体成像系统 | Caliper | -- |
| 代谢笼分析 | 综合实验室动物监测系统 | Columbus Instruments | -- |
| 组织学分析 | OLYMPUS正置显微镜BX53 | Olympus Corporation | -- |
| snRNA-seq | gentle MACS组织解离仪 | Miltenyi Biotec | -- |
| NucBlue细胞核染料 | ThermoFisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 中年小鼠HFD模型与EVs干预 | 小鼠年龄（12月龄）、性别（雄性/雌性）、HFD配方（60% kcal fat，D12492）、喂养时长（4周）、EVs剂量（30 μg/只/周）及给药途径（静脉注射） 阅读提示：Methods中Mice小节及Fig. 3a图注 |
| BMDMs极化与EVs/miR-145处理 | BMDMs来源（6周C57BL/6小鼠骨髓）、M-CSF浓度（30 ng/mL及20 ng/mL）、LPS浓度（100 ng/mL）、EVs浓度（50 ng/mL）及处理时间（24 h）、miR-145 mimics（50 nM）/inhibitor（100 nM）转染条件 阅读提示：Methods中Cell culture and treatment及miR-145 overexpression or inhibition小节 |
| miR-145@tar-lip体内治疗 | 脂质体剂量（1 mg miRNA/kg体重）、给药频率（每3天一次）、给药途径（静脉注射）、小鼠年龄（12月龄）、HFD时长（4周）及每组样本量（n=7） 阅读提示：Methods中Mice小节及Fig. 7a图注 |
| SELL–NF-κB机制验证 | Sell siRNA浓度（100 nM）、转染试剂（Lipofectamine 3000）、腺病毒过表达滴度（10^7 particles/well）、NF-κB激动剂CU-T12-9浓度（10 μM）及处理时间（12 h）、荧光素酶报告基因转染质粒量及检测时间（48 h） 阅读提示：Methods中Transfection of siRNA、Adenoviral transduction、Luciferase reporter assays小节 |
| ATMs分离与巨噬细胞清除实验 | CD11b磁珠品牌及货号（Miltenyi Biotec, #130-049-601）、氯膦酸盐脂质体剂量（110 mg/kg）及给药频率（每周两次，腹腔注射） 阅读提示：Methods中Adipose tissue-derived macrophages isolation及Mice小节 |