细胞同步化与时间点收集
获得高同步化的细胞群体以进行细胞周期阶段特异性分析。
使用帕博西尼（CDK4/6抑制剂）将RPE-1细胞阻滞在晚G1期，释放后收集0、2、4、6、8、10、12、15小时的样本，对应晚G1、G1/S、S、S/G2、G2、G2/M、M/G1期；另使用DMA诱导前中期阻滞并释放至早期G1，以及血清饥饿诱导G0/G1同步化。
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非转化细胞中细胞周期依赖性蛋白质和磷酸化丰度变化的高分辨率分析
High resolution profiling of cell cycle-dependent protein and phosphorylation abundance changes in non-transformed cells.
实验完整度
高包含体外细胞模型、蛋白质组和磷酸化蛋白质组学、Western blot验证、功能验证及机制探索。
主要模型
hTERT-RPE-1细胞系 HeLa Kyoto细胞系 HeLa FRT/TR 3xFLAG-Venus-SBP-APC4细胞系
重点核对
帕博西尼诱导细胞同步化的浓度（150 nM）和处理时间（24 h） DMA诱导前中期阻滞的浓度（1 μM）和处理时间（4 h） 质谱分析中TMTpro 16-plex标记和磷酸肽富集（Fe-NTA）的关键步骤 Western blot验证中使用的抗体稀释比例和独立实验重复次数（至少三次） ANAPC4耗竭实验中NAA（0.5 mM）、taxol（245 nM）和RO-3306（9 μM）的浓度
摘要
细胞周期控制着一系列精确的分子事件，这些事件通过蛋白质和磷酸化丰度的协调变化来调控，最终产生两个子细胞。在此，我们通过同量异位标记的深度定量质谱，对人细胞周期进行了蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析，研究对象为hTERT-RPE-1细胞。通过分析非转化细胞并提高关键细胞周期调控因子的时间分辨率和覆盖度，我们呈现了一个细胞周期依赖性蛋白质和磷酸化位点振荡的数据集，为研究细胞周期调控提供了基础参考。这些数据揭示了调控的复杂性，包括表现出细胞周期依赖性振荡的蛋白质和磷酸化位点，以及在有丝分裂退出期间被靶向降解的蛋白质。与互补资源整合后，我们的数据将周期依赖性丰度动态与功能变化联系起来，并可通过细胞周期数据库（CCdb）访问，这是一个面向细胞周期研究社区的交互式网络资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何在高时间分辨率和覆盖度下，解析非转化人类细胞中细胞周期依赖性的蛋白质和磷酸化丰度变化？
- 核心机制
- 细胞周期进程由蛋白质丰度振荡和磷酸化动态共同调控，其中磷酸化变化可独立于蛋白质丰度变化，并涉及蛋白质降解机制。
- 主要证据
- 通过TMT定量质谱分析RPE-1细胞在七个细胞周期阶段的蛋白质组和磷酸化蛋白质组，结合DMA诱导的前中期阻滞和释放，鉴定出401个细胞周期依赖性蛋白质和6528个磷酸化位点，并通过Western blot验证了关键蛋白质和磷酸化变化。
- 研究意义
- 提供了细胞周期依赖性蛋白质和磷酸化振荡的参考数据集，并建立了可交互访问的CCdb数据库，为细胞周期研究社区提供资源。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
蛋白质组和磷酸化蛋白质组样品制备与质谱分析
定量分析不同细胞周期阶段的蛋白质和磷酸化丰度变化。
细胞裂解后，蛋白质用胰蛋白酶消化，肽段用TMTpro 16-plex试剂标记，磷酸肽用Fe-NTA金属亲和树脂富集，然后进行LC-MS/MS分析。
定义细胞周期依赖性（CCD）蛋白质和磷酸化位点
识别在细胞周期中显著振荡的蛋白质和磷酸化事件。
对时间进程数据集进行ANOVA分析和曲线拟合，计算曲线倍数变化，基于GO术语富集确定阈值；对有丝分裂退出数据集使用limma分析。
CCD蛋白质的降解机制验证
验证预测的APC/C底物在细胞有丝分裂退出时的降解。
在HeLa细胞中通过生长素诱导的ANAPC4耗竭，结合RO-3306和MG132处理，用Western blot检测候选蛋白质的稳定性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞同步化 | 帕博西尼 | -- | -- |
| 二甲基乙内酰脲（DMA） | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| Glutamax | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 两性霉素B | -- | -- | |
| 流式细胞术 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| 核糖核酸酶 | -- | -- | |
| 蛋白质组样品制备 | Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Quick Start Bradford蛋白测定 | Bio-Rad | -- | |
| 三(2-羧乙基)膦 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| TMTpro-16plex试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 磷酸肽富集 | High-Select Fe-NTA磷酸肽富集试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 质谱分析 | Orbitrap Lumos质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Acclaim PepMap C18捕集柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Acclaim PepMap C18毛细管柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 高pH反相色谱 | XBridge C18柱 | Waters | -- |
| Dionex UltiMate 3000高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | CCND1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 |
| CCND3抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-6283 | |
| CCNE2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-248 | |
| CCNA抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-271682 | |
| CCNA抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-596 | |
| CCNB1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-51907 | |
| CDK1 pT161抗体 | Cell Signalling Technology | 9114 | |
| CDK1 pY15抗体 | Cell Signalling Technology | 9111 | |
| α-微管蛋白抗体 | Abcam | ab52866 | |
| PLK1抗体 | Millipore | 05-844 | |
| CDK2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-163 | |
| CDK1抗体 | Abcam | ab32094 | |
| CDC20抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-13162 | |
| UBR7抗体 | Thermo Fisher Scientific | A304-130A | |
| UBE2S抗体 | Cell Signalling Technology | 11878 | |
| CDKN1B抗体 | Dako | M7203 | |
| CDKN1B pS10抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-12939 | |
| NCL抗体 | Abcam | ab22758 | |
| NCL pT76抗体 | Abcam | ab168363 | |
| SGO2抗体 | Thermo Fisher Scientific | A301-261A | |
| GTSE1抗体 | Abnova | H00051512-B01P | |
| MELK抗体 | Thermo Fisher Scientific | A303-136A | |
| FAM83D抗体 | Custom antibody from Erich Nigg | -- | |
| ANAPC4抗体 | Thermo Fisher Scientific | A301-175A | |
| 磷酸化CDK底物基序[(K/H)pSP]抗体 | Cell Signalling Technology | 9477 | |
| JUNB抗体 | Proteintech | 10486-1-AP | |
| CHAF1B抗体 | Thermo Fisher Scientific | A301-085A | |
| 组蛋白H3 pS10抗体 | Cell Signalling Technology | 3377 | |
| 肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| IRDye 680RD驴抗兔IgG (H + L) | LI-COR Biosciences | 926-68073 | |
| IRDye 800CW驴抗兔IgG (H + L) | LI-COR Biosciences | 926-32213 | |
| IRDye 800CW驴抗鼠IgG (H + L) | LI-COR Biosciences | 926-32212 | |
| 抗鼠HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | |
| 抗兔HRP | Cell Signalling Technology | 7074 | |
| 免疫荧光 | Hoechst 33342 | -- | -- |
| Alexa Fluor 647山羊抗鼠 | Invitrogen | A-21236 | |
| Alexa Fluor 488鸡抗兔 | Invitrogen | A-21441 | |
| ANAPC4耗竭实验 | 1-萘乙酸 | -- | -- |
| 紫杉醇 | -- | -- | |
| RO-3306 | -- | -- | |
| MG-132 | -- | -- | |
| cOmplete蛋白酶混合物 | Roche | -- | |
| PhosSTOP片剂 | Roche | -- | |
| 苯甲酸酶 | Millipore | E1014 | |
| NuPAGE LDS样品缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | Odyssey近红外扫描系统 | LICOR | -- |
| SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞同步化（时间进程数据集） | 帕博西尼浓度150 nM，处理24小时；释放后收集时间点0、2、4、6、8、10、12、15小时；每个时间点两个生物学重复。 阅读提示：Methods: Cell synchronisation |
| 细胞同步化（有丝分裂退出数据集） | 帕博西尼释放10小时后，DMA浓度1 μM处理4小时；有丝分裂细胞通过摇落收集；释放后0小时（前中期阻滞）和5小时（早期G1）收集；三个生物学重复。 阅读提示：Methods: Cell synchronisation |
| 质谱样品制备 | 蛋白质消化使用胰蛋白酶75 ng/μL；TMTpro 16-plex标记；磷酸肽富集使用Fe-NTA树脂；质谱分析使用Orbitrap Lumos。 阅读提示：Methods: Sample preparation for proteomics and phosphoproteomics analysis; Phosphopeptide enrichment; Liquid Chromatography (LC) Mass Spectrometry (MS) analysis |
| CCD蛋白质和磷酸化位点定义 | ANOVA q ≤ 0.01；曲线倍数变化 ≥ 1.2（蛋白质）或 ≥ 1（磷酸化位点）；limma调整p ≤ 0.01，蛋白质log2倍数变化 ≥ |0.5|，磷酸化位点log2倍数变化 ≥ 1。 阅读提示：Methods: Defining cell cycle-dependent (CCD) proteins and phosphorylation sites |
| ANAPC4耗竭实验 | 胸苷2.5 mM处理24小时；NAA 0.5 mM和taxol 245 nM处理13小时；RO-3306 9 μM；MG-132 10 μM；Western blot检测。 阅读提示：Methods: ANAPC4 depletion assay |